TGF-βRⅡ靶向并激活NK-92細胞的腫瘤免疫治療作用.pdf

1、目的：
　　很多腫瘤可以通過分泌TGF-β抑制NK及T淋巴細胞的功能，促進腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。NK細胞有激活和抑制型兩種受體，NK細胞是否有殺傷功能取決于它所接受的激活型信號和抑制型信號的強弱。NKG2D是NK細胞的激活型受體，其信號可以介導NK細胞的殺傷功能。因此我們首先克隆了TGF-βRⅡ的胞外段和跨膜區(qū)以及NKG2D的胞內(nèi)段（TN）基因，用重疊延伸拼接PCR（SOE-PCR）的方法將兩段基因拼接起來。并采用了慢病毒感染的方法制

2、備了攜帶TN的NK-92穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系。表面TGF-βRⅡ的表達可以將NK細胞靶向到高表達TGF-β的腫瘤微環(huán)境，與TGF-β的結(jié)合可以激活NKG2D的活化信號，即激活NK細胞的殺傷功能；與微環(huán)境中TGF-β的結(jié)合還能夠降低其對其它細胞的抑制及對調(diào)節(jié)性T細胞的誘導。我們通過體外和體內(nèi)實驗研究了攜帶TN的NK-92細胞的腫瘤免疫治療作用。
　　方法：
　?。?）采用RT-PCR和重疊延伸PCR獲得TN基因，構(gòu)建含有重組TN基因的慢

3、病毒穿梭質(zhì)粒，并與其它包裝質(zhì)粒一起通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染293T細胞，得到假病毒，用于感染NK-92細胞，獲得攜帶TN基因的NK-92細胞系。
　?。?）通過Elisa方法檢測腫瘤細胞分泌TGF-β1的分泌，獲得高表達TGF-β1用于腫瘤殺傷和動物模型的腫瘤細胞系
　?。?）通過Transwell實驗，Cell Counting Kit-8（CCK8）表達檢測NK-92-TN細胞的遷移及存活能力。
　?。?）通過細胞毒實驗，流

4、式細胞術(shù)方法分析NK-92-TN的腫瘤細胞殺傷能力和激活程度。
　?。?）通過將臍血來源的CD4+T細胞在TGF-β1誘導下與NK-92-TN細胞共培養(yǎng)，檢測其對調(diào)節(jié)性T細胞分化的影響。
　?。?）采用肝癌SMMC7721細胞移植腫瘤裸鼠模型，研究NK-92-TN細胞的腫瘤免疫治療作用。
　　結(jié)果：
　?。?）成功克隆了TGF-βRⅡ的胞外段和跨膜區(qū)以及NKG2D的胞內(nèi)段（TN）這一段融合基因，獲得了慢病毒重組穿

5、梭質(zhì)粒，并與其它包裝質(zhì)粒一起通過磷酸鈣法感染293T細胞，獲得了NK-92-TN穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系。
　?。?）檢測發(fā)現(xiàn)SMMC7721，HepG2肝癌細胞可以分泌較高水平的TGF-β1。
　?。?）通過CCK-8檢測和Transwell實驗發(fā)現(xiàn)，NK-92-TN細胞的存活和遷移能力較對照細胞系更強。
　?。?）與對照細胞系相比，NK-92-TN細胞表面NKG2D的表達更高，且不受TGF-β1的抑制。同時較對照細胞其IFN-γ

6、分泌水平較高。
　?。?）與對照細胞系相比，NK-92-TN細胞的腫瘤殺傷作用更強，而且在TGF-β1的刺激下，NK-92-TN細胞的殺傷作用提高，表明TGF-β1對NK-92-TN細胞具有活化作用。
　　（6）與對照組相比，NK-92-TN細胞能夠抑制調(diào)節(jié)性 T細胞的分化，且具有劑量依賴性。
　?。?）體內(nèi)實驗初步證明了 NK-92-TN細胞聯(lián)合低劑量放療能夠有效地抑制肝癌細胞的生長。
　　結(jié)論：
　　本