骨骼肌特異表達(dá)IGF-1基因轉(zhuǎn)基因綿羊研究.pdf

1、自“多莉”誕生以來,體細(xì)胞核移植技術(shù)在家畜中的應(yīng)用的到了長遠(yuǎn)的發(fā)展。以轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞為供體細(xì)胞,利用核移植技術(shù)成產(chǎn)轉(zhuǎn)基因家畜成為研究的熱點(diǎn)。本研究擬構(gòu)建骨骼肌特異表達(dá)胰島素生長因子Ⅰ真核表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)染綿羊胎兒成纖維細(xì)胞,篩選出外源目的基因穩(wěn)定整合的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞克隆。以轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞為核供體,通過體細(xì)胞核移植技術(shù)制備轉(zhuǎn)基因胚胎,并通過胚胎移植的移入受體綿羊體內(nèi),生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物。
　　 1.骨骼肌特異表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 1:通

2、過PCR克隆出豬血基因組α-actin5'端調(diào)控區(qū)與綿羊IGF-1cDNA序列相連得到中間載體p19T-CI,p19T-CI經(jīng)SphI+SacI酶切,得到目的片段CI,將CI連接到骨架載體pCDsReD2上,得到真核表達(dá)載體pCICDS,酶切鑒定插入是否正確:
　　 2.人工合成肌肉特異啟動子SP片段,和綿羊cDNA連接得到中間載體p19T-SPI,酶切p19T-SPI得到目的片段SPI,將SPI與骨架載體pCDsReD2相連,

3、得到表達(dá)載體pSPICDS,并酶切鑒定。構(gòu)建成功的真核表達(dá)載體均經(jīng)酶切鑒定證明插入位置正確,載體構(gòu)建成功。
　　 2.綿羊成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)及基因轉(zhuǎn)染
　　 使用組織貼壁法得到綿羊胎兒成纖維細(xì)胞,使用脂質(zhì)體Lip2000TM將骨骼肌特異表達(dá)載體pSPICDS、pCICDS轉(zhuǎn)入綿羊成纖維細(xì)胞基因組中。使用G418藥物篩選轉(zhuǎn)基因細(xì)胞,同時(shí)利用紅色熒光蛋白進(jìn)一步得到細(xì)胞克隆。通PCR的方法鑒定轉(zhuǎn)基因細(xì)胞克隆來源胎兒性別與檢測

4、外源基因是否整合到細(xì)胞基因組中。通過繪制生長曲線與制備轉(zhuǎn)基因細(xì)胞染色體核型分析,評估轉(zhuǎn)基因細(xì)胞活性。結(jié)果證明獲得同時(shí)具有G418抗性與表達(dá)紅色熒光蛋白的細(xì)胞克隆,并鑒定出細(xì)胞性別,外源目的基因已經(jīng)穩(wěn)定整合入細(xì)胞基因組中,生長曲線與核型分析顯示轉(zhuǎn)基因細(xì)胞基本正常。表明我們得到的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞可以作為供體細(xì)胞,用于體細(xì)胞核移植實(shí)驗(yàn)。
　　 3.轉(zhuǎn)基因胚胎的制備與胚胎移植
　　 通過顯微操作的方法吸出成熟卵母細(xì)胞的第一極體和細(xì)胞核

5、,將轉(zhuǎn)pSPICDS、pCICDS轉(zhuǎn)基因SFCs供體細(xì)胞注入卵子。通過電融合將供體細(xì)胞與去核卵母細(xì)胞進(jìn)行融合,5μMIA231875min+2mM6-DMAP4hr激活方法,激活重構(gòu)胚胎,并在體外發(fā)育液中進(jìn)一步發(fā)育。通過PCR法鑒定轉(zhuǎn)基因胚胎外源基因整合情況;使用激光共聚焦顯微鏡觀察紅色熒光蛋白的表達(dá);挑取形態(tài)均勻的4～8細(xì)胞轉(zhuǎn)基因胚胎進(jìn)行胚胎移植。綿羊卵母細(xì)胞成熟率為67％,融合率為61.7％,重構(gòu)胚胎卵裂率為79.5％,八細(xì)胞率為5