電脈沖介導(dǎo)的DNA疫苗骨骼肌內(nèi)免疫接種的轉(zhuǎn)基因長期表達和抗原遞呈機理的研究.pdf

1、電脈沖介導(dǎo)的 DNA 免疫 (DNA+EP) 可以明顯增強DNA疫苗的免疫效果.但其中的作用機理不明確,我們希望從DNA+EP免疫轉(zhuǎn)基因表達,和DNA+EP免疫后抗原遞呈兩個角度,討論其中的具體過程和作用機理. 我們發(fā)現(xiàn),DNA+EP 免疫對作用區(qū)域的骨骼肌會造成一定程度的損傷,骨骼肌的創(chuàng)傷隨著離電極距離增加而減弱.在電極附近,電脈沖將骨骼肌的肌束膜和肌內(nèi)膜擊穿,釋放出游離的肌細胞,這些肌細胞由于受到過度損傷而發(fā)生橫紋肌溶解導(dǎo)致壞死/凋

2、亡;在離電極較遠的區(qū)域,電脈沖僅將肌束膜擊穿,釋放出游離的肌細胞,但并不會引起這些細胞壞死/凋亡. DNA+EP 免疫對骨骼肌的損傷將在局部區(qū)域引發(fā)較嚴重的炎癥反應(yīng).DNA+EP作用2小時后,受損傷部位的骨骼肌中有大量的血球滲出,這些細胞多數(shù)是多形核細胞.到第3天,炎癥浸潤細胞中多電脈沖介導(dǎo)的DNA疫苗骨骼肌內(nèi)免疫接種的轉(zhuǎn)基因長期表達和抗原遞呈機理的研究數(shù)是單個核細胞.作用5-7天后,骨骼肌中的炎癥浸潤細胞最多;作用14天后,炎

3、癥反應(yīng)逐漸減輕成為灶性炎癥并最終大約于21天后基本消退. 在炎癥反應(yīng)的早期,免疫組化實驗結(jié)果顯示骨骼肌中的浸潤細胞主要為炎癥性巨噬細胞,很少CDllc陽性細胞即DC細胞.直到DNA+EP作用后第14天,炎癥浸潤細胞才出現(xiàn).DC細胞;炎癥性DC細胞存在于骨骼肌中至電脈沖作用后第21天炎癥基本消失時為止. 在炎癥反應(yīng)中后期,炎癥浸潤細胞中還有大量T細胞.CD4<'+>T細胞和CD8<'+>T細胞都在電脈沖作用后第5天即可在骨

4、骼中檢測到。CD4<'+>T細胞在電脈沖作用后第7天時數(shù)量達到最多；CD8<'+>T細胞在電脈沖作用后第14天時數(shù)量達到最多。CD4<'+>T細胞和CD8<'+>T細胞存在于骨骼肌中直到電脈沖作用后第21天.由于這些T細胞浸潤表達抗原的肌細胞,因此它們可能是抗原特異性的. DNA+EP引起的炎癥細胞浸潤一方面是由于骨骼肌中由于大量趨化因子基因表達增加,對炎癥細胞趨化的結(jié)果.cDNA芯片分析顯示:DNA+EP作用2小時后MIP-1

5、a基因表達增加約8倍,MIP-1B基因表達增加約4倍,MIP-1γ,基因表達增加約4倍,MIP-3a基因表達增加約3倍,MCP-2基因表達增加約3倍,IP-10基因表達增加約10倍,lvmphotactin基因表達增加約27倍,fractalkine基因表達增加約9倍.DNA+EP還引起骨骼肌中趨化因子受體基因表達增加.DNA+EP作用2小時后,CCR5基因表達增加約5倍,CXCR-4基因表達增加約4倍. DNA+EP引起的炎癥

6、細胞浸潤另一方面是骨骼肌中由于大量細胞壞死/凋亡,需要吞噬細胞如多形核細胞、巨噬細胞清除細胞碎片.DNA+EP作用2小時后Caspase-8基因表達增加230倍.Caspase-1基因表達增加了44倍.cyplal基因表達增加了37倍,cypla2基因表達增加了59倍,MT2基因表達增加了6倍. DNA+EP作用后,引流淋巴結(jié)中單核細胞數(shù)量沒有明顯變化.但是引流淋巴結(jié)中的巨噬細胞數(shù)量增加約一倍,DCs細胞數(shù)量增加約3倍.而且,D

7、NA+EP作用后,引流淋巴結(jié)中CCR-1～CCR-9等趨化因子受體基因表達增加,顯示T細胞活化. DNA+EP作用后,組織中的炎癥性單核細胞/巨噬細胞可以通過兩種方式獲得抗原(GFP).第一,一些炎癥性單核細胞/巨噬可以通過攝取質(zhì)粒DNA然后內(nèi)源性表達抗原(直接轉(zhuǎn)染).第二,大多數(shù)炎癥性單核細胞/巨噬細胞通過吞噬肌細胞分泌的外源蛋白得到抗原.同時,在引流淋巴結(jié)的T細胞區(qū)域可以觀察到裝載了抗原(GFP,QDs)的炎癥性單核細胞/巨

8、噬細胞.顯示炎癥性單核細胞/巨噬細胞可能有抗原遞呈的作用. 應(yīng)用新的DNA免疫策略,我們發(fā)現(xiàn):EP+3d+DNA免疫比EP+1d+DNA免疫或EP+DNA免疫可以更加迅速的誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答.而且免疫后2周時EP+3d+DNA免疫誘導(dǎo)的中和抗體水平顯著高于EP+1d+DNA免疫或EP+DNA免疫誘導(dǎo)的中和抗體水平(P<0.05).雖然在免疫后4周時EP+3d+DNA免疫誘導(dǎo)的中和抗體水平與EP+DNA免疫誘導(dǎo)的中和抗體水平相當,仍

9、然顯著高于EP+1d+DNA誘導(dǎo)的中和抗體水平(P<0.05).以上結(jié)果由兩方面原因引起:一,DNA+EP免疫產(chǎn)生的抗原比EP+1d+DNA免疫產(chǎn)生的抗原多400倍以上.二,骨骼肌中的炎癥性單核細胞/巨噬細胞的數(shù)量在EP+3d+DNA免疫中DNA接種時比在EP+1d+DNA免疫中DNA接種時多. 此外,將重組乙肝表面蛋白(HBS)通過EP+3d+HBS免疫小鼠,發(fā)現(xiàn)預(yù)先誘導(dǎo)骨骼肌產(chǎn)生炎癥性單核細胞/巨噬細胞浸潤也有助于增強蛋白疫

10、苗引起的免疫應(yīng)答. 而且,從EP+3d+DNA免疫和DNA+EP免疫的小鼠的引流淋巴結(jié)中分離出來的單核細胞/巨噬細胞比從直接肌肉內(nèi)注射DNA免疫的小鼠的引流淋巴結(jié)中分離出來的單核細胞/巨噬細胞更能有效誘導(dǎo)同種基因的、抗原特異性的CD4<'+>T細胞在體外增殖. 以上結(jié)果表明,炎癥性單核細胞/巨噬細胞是DNA+EP免疫后主要的抗原遞呈細胞. 另一方面,我們發(fā)現(xiàn)在DNA+EP作用后2小時,骨骼肌中MyoD基因開始轉(zhuǎn)錄

11、;DNA+EP作用后1天,電脈沖的電極附近的單個核細胞中表達MyoD蛋白.DNA+EP作用后第3天,電極附近的肌細胞發(fā)生橫紋肌溶解留下大片空隙.DNA+EP作用后第5天,肌細胞開始再生.DNA+EP作用后第7天,再生的肌細胞重新形成肌束.DNA+EP免疫后14天.21天,再生骨骼肌體積增大.DNA+EP免疫后60天,受傷的骨骼肌基本恢復(fù)正常.結(jié)果顯示,DNA+EP激活了衛(wèi)星細胞并分化成再生肌細胞. 應(yīng)用質(zhì)粒DNA標記系統(tǒng),我們發(fā)

12、現(xiàn)質(zhì)粒DNA在骨骼肌中的分布可分成兩部分:在離電極較遠的區(qū)域,質(zhì)粒DNA主要分布在肌細胞的間隙;在電極附近區(qū)域,質(zhì)粒DNA主要分布在活化的衛(wèi)星細胞內(nèi). 對DNA+EP作用后骨骼肌中報道基因GFP表達進行系統(tǒng)研究表明:第1天, GFP主要表達在游離的肌細胞中;第3.5天, G:FP主要表達在離電極較遠的區(qū)域的預(yù)先存在的肌細胞中,同時用confocal顯微鏡可以在新生肌中觀察到GFP表達;第7天,預(yù)先存在的肌細胞中的GFP表達減少,

13、同時,由于新生肌細胞體積增大,新生肌細胞中表達的GFP也有所增加,在confocal顯微鏡可以更加容易觀察到;第14-21天,預(yù)先存在的肌細胞中的GFP表達逐漸減少至觀察不到;但是同時隨著再生肌細胞體積增大,再生肌細胞中表達的GFP大量增加以至在普通顯微鏡下也可以觀察到.結(jié)果進一步顯示,質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染了骨骼肌中的衛(wèi)星細胞,衛(wèi)星細胞分化而來的電脈沖介導(dǎo)的DNA疫苗骨骼肌內(nèi)免疫接種的轉(zhuǎn)基因長期表達和抗原遞呈機理的研究再生肌細胞是骨骼肌中長期

14、表達轉(zhuǎn)基因的主要原因之一.應(yīng)用Luciferase報道基因定量研究DNA+EP作用后基因表達,結(jié)果表明持續(xù)中高水平(約為最高值的1/20)的基因表達可維持數(shù)周(基因輸送后28天). 綜上所述:一方面,DNA+EP免疫引起較嚴重的以單核細胞/巨噬細胞為主的炎癥反應(yīng),多數(shù)炎癥性單核細胞/巨噬細胞通過吞噬肌細胞表達的抗原、少數(shù)可能通過吞噬DNA后表達抗原(直接轉(zhuǎn)染),然后遞呈抗原,致敏免疫系統(tǒng).但是,引流淋巴結(jié)中的DCs可能也起到了抗