骨骼肌缺血再灌注后心肌損傷的免疫機(jī)理及調(diào)控研究.pdf

1、背景與目的:四肢手術(shù)如全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)等使用止血帶等可引起骨骼肌缺血再灌注損傷并通過炎癥反應(yīng)氧化應(yīng)激等途徑引起遠(yuǎn)隔重要器官甚至全身多器官損傷,其中以心血管系統(tǒng)的損傷最為重要。我們前期對骨骼肌缺血再灌注心肌損傷的機(jī)制進(jìn)行了初步研究,發(fā)現(xiàn)炎細(xì)胞在心肌組織的聚集活化、全身及心肌局部炎性細(xì)胞因子的激活、過度的氧化應(yīng)激及氧化-抗氧化體系的失衡、醛固酮的持續(xù)激活是骨骼肌缺血期及再灌注期心肌損傷的重要病理學(xué)基礎(chǔ),但其中的免疫調(diào)控機(jī)制還不是十分清楚。近來

2、研究發(fā)現(xiàn)以高遷移率族蛋白B1(high-mobility group box protein1,HMGB1)及Toll樣受體4(Toll-like receptor,TLR4)激活為特征的固有免疫系統(tǒng)激活在心、肺、肝、腎等臟器缺血再灌注損傷中具有重要作用。髄樣分化初極反應(yīng)基因88(Myeloid differentiation primary-responsegene88,MyD88)是TLR4主要的銜接蛋白,TLR4和MyD88結(jié)合后

3、可以激活下游的核因子-kB(NF-kB)信號(hào)通路,促發(fā)炎癥反應(yīng)。而HMGB1-TLR4-MyD88-NF-kB信號(hào)通路在骨骼肌缺血再灌注致遠(yuǎn)隔心肌損傷中的作用還不清楚,也未見研究報(bào)道。本研究通過:一、觀察全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后患者單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞TLR4表達(dá)及血漿炎性細(xì)胞因子IL-6的變化,以及手術(shù)后細(xì)胞免疫、體液免疫及心肌損傷指標(biāo)TnI的變化,明確全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)致心肌損傷的作用及術(shù)后免疫功能的改變。二、觀察HMGB1-TLR4-MyD8

4、8-NF-kB信號(hào)通路以及炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-10、IL-17HMGB1在大鼠骨骼肌缺血再灌注心肌細(xì)胞損傷中的作用,及H2S和螺內(nèi)酯(Spiron)對該信號(hào)通路及炎性細(xì)胞因子的調(diào)控作用,進(jìn)一步深入研究骨骼肌缺血再灌注后心肌損傷的心肌局部免疫調(diào)控變化,并尋求有效的干預(yù)途徑。同時(shí)觀察HMGB1-TLR4-MyD88-NF-kB信號(hào)通路以及炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-10、IL-17在大鼠骨骼肌缺血再灌注合并骨折及軟組織創(chuàng)傷后心肌損傷

5、中的作用,對嚴(yán)重的肢體復(fù)合傷造成心肌損傷的免疫機(jī)理進(jìn)行初步探討。
　　方法:第一部分:雙膝關(guān)節(jié)置換(術(shù)中須用止血帶)手術(shù)病人15例,觀察時(shí)間點(diǎn):術(shù)前、術(shù)后4h、術(shù)后12h,采用自身對照研究。觀察患者手術(shù)前后血漿肌鈣蛋白-I(TnI)及IL-6、IgG、IgM、IgA水平的變化,利用流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)觀察患者手術(shù)前后淋巴細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+及單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞TLR4表達(dá)的變化。第二部分:雄性Wistar大鼠46只,應(yīng)

6、用止血帶結(jié)扎構(gòu)建大鼠雙下肢缺血再灌注模型,隨機(jī)分為6組,除IR+創(chuàng)傷組有6只大鼠外,其余各組均有8只大鼠:(1)C組:正常對照組。(2)IR組:缺血4小時(shí)再灌注4小時(shí)組。(3)IR+創(chuàng)傷組:大鼠雙下肢結(jié)扎后,制造骨骼肌缺血再灌注加右股骨骨折及軟組織損傷的復(fù)合創(chuàng)傷模型。骨骼肌缺血時(shí)間和再灌注時(shí)間同IR組。(4)IR+NaHS組:結(jié)扎前及再灌注前腹腔注射H2S供體硫氫化鈉(NaHS)0.78mg/kg。(5)IR+PPG組:結(jié)扎前及再灌注前

7、腹腔注射CSE酶抑制劑炔丙基甘氨酸(DL-propargylglycine,PPG)60mg/kg。(6)IR+Spiron組:結(jié)扎前每天給予Spiron(20mg/kg)灌胃持續(xù)6天。觀察各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡的改變及血漿心肌酶TnI的變化,觀察大鼠血漿及心肌IL-6、IL-10、IL-17、HMGB1水平的變化,以WesternBlot方法檢測大鼠心肌HMGB1、TLR4、MyD88、NF-κBp65、P-NF-κBp65蛋白含量,以

8、RealtimePCR方法檢測大鼠心肌HMGB1、TLR4、MyD88mRNA表達(dá),以免疫組化法觀察大鼠心肌TLR4、P-NF-κBp65的表達(dá)。
　　結(jié)果:第一部分:全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后4小時(shí)血漿單核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞表面TLR4表達(dá)、IL-6、TnI水平較術(shù)前明顯上升(P<0.05),炎性細(xì)胞因子IL-6水平術(shù)后12小時(shí)較術(shù)后4小時(shí)繼續(xù)顯著上升(P<0.05),血漿單核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞表面TLR4表達(dá)及TnI水平術(shù)后12小時(shí)持續(xù)處于

9、高水平,較術(shù)后4小時(shí)沒有繼續(xù)上升(P>0.05)。全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后12小時(shí)T淋巴細(xì)胞亞群CD4+的數(shù)量及CD4+/CD8+細(xì)胞比值明顯下降(P<0.05)。全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后IgG、IgM、IgA水平?jīng)]有明顯變化(P>0.05)。第二部分:與正常對照組比較,骨骼肌缺血再灌注組大鼠血漿TnI水平及心肌凋亡指數(shù)明顯升高,血漿及心肌IL-6、IL-10、IL-17、HMGB1水平顯著上升,心肌HMGB1、TLR4、MyD88、P-NF-κBp6

10、5蛋白含量明顯上升,心肌HMGB1、TLR4、MyD88mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(allP<0.05)。與骨骼肌缺血再灌注組比較,H2S和螺內(nèi)酯干預(yù)可以明顯降低血漿TnI水平及心肌凋亡指數(shù),降低血漿及心肌IL-6、IL-17、HMGB1水平,升高血漿及心肌IL-10水平,使心肌HMGB1、TLR4、MyD88、P-NF-κBp65蛋白含量明顯下降,心肌HMGB1、TLR4、MyD88mRNA表達(dá)顯著下調(diào)(allP<0.05);PPG干預(yù)和缺

11、血再灌注合并創(chuàng)傷可以使血漿TnI水平及心肌凋亡指數(shù)繼續(xù)升高,血漿及心肌IL-6、IL-17、HMGB1水平進(jìn)一步升高,使心肌HMGB1、TLR4、MyD88、P-NF-κBp65蛋白含量明顯上升,心肌HMGB1、TLR4、MyD88mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(allP<0.05),對血漿及心肌IL-10水平?jīng)]有顯著影響(P>0.05)。各組大鼠NF-κBp65蛋白表達(dá)沒有顯著差異(P>0.05)。免疫組化提示缺血再灌注組大鼠心肌細(xì)胞可見較多T

12、LR4、P-NF-κBp65抗體陽性棕色染色顆粒,H2S和螺內(nèi)酯干預(yù)組心肌細(xì)胞棕色染色顆粒明顯減少,PPG干預(yù)和缺血再灌注合并骨創(chuàng)傷組棕色陽性染色顆粒進(jìn)一步增多。
　　結(jié)論:1,全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)可造成心肌損傷,并激活機(jī)體的固有免疫及炎癥反應(yīng),同時(shí)抑制細(xì)胞免疫功能。2、大鼠骨骼肌缺血再灌注可以上調(diào)全身和心肌局部的內(nèi)源性危險(xiǎn)分子HMGB1,激活心肌的固有免疫TLR4-MyD88-NF-κB信號(hào)通路,使血漿及心肌局部的前炎癥細(xì)胞因子IL-

13、6、IL-17及抗炎因子IL-10大量釋放,從而加重心肌細(xì)胞凋亡和損傷。3、硫化氫供體NaHS以及醛固酮特異性拮抗劑螺內(nèi)酯均可以通過降低大鼠骨骼肌缺血再灌注后全身和心肌局部的內(nèi)源性危險(xiǎn)分子HMGB1的水平,抑制心肌的固有免疫TLR4-MyD88-NF-κB信號(hào)通路激活,下調(diào)血漿及心肌的前炎癥細(xì)胞因子IL-6、IL-17水平,增加血漿和心肌的抗炎細(xì)胞因子IL-10的水平,從而減輕骨骼肌缺血再灌注后心肌的炎癥反應(yīng)及心肌細(xì)胞凋亡和損傷。證明醛