早期肺鱗癌相關(guān)蛋白的篩選及其表達(dá)驗(yàn)證.pdf_第1頁
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文檔簡(jiǎn)介

1、為了篩選、鑒定出早期肺鱗癌相關(guān)的蛋白質(zhì),以Ⅰ期肺鱗癌組織以及相應(yīng)的癌旁正常肺組織、I期肺鱗癌患者血清和健康正常人血清為研究對(duì)象和材料,聯(lián)合應(yīng)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)方法和血清學(xué)蛋白質(zhì)組分析方法篩選早期肺鱗癌相關(guān)蛋白。本研究可豐富人類對(duì)肺組織蛋白質(zhì)組的認(rèn)識(shí),同時(shí)通過相應(yīng)的鑒定和驗(yàn)證,期望發(fā)現(xiàn)肺鱗癌中特異性的蛋白質(zhì),為肺癌的早期診斷提供依據(jù),也將有助于進(jìn)一步揭示肺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。研究目的:1.通過優(yōu)化雙向電泳及免疫印跡技術(shù),建立穩(wěn)定的比較蛋白

2、質(zhì)組學(xué)和血清學(xué)蛋白質(zhì)組技術(shù)平臺(tái),結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(Matrix-assistedlaser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)技術(shù),篩選和鑒定出早期肺鱗癌差異蛋白質(zhì)。2.通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,RQ-PCR)、Western Blot、免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)肺鱗癌

3、差異蛋白在基因、蛋白水平的表達(dá)情況,驗(yàn)證蛋白質(zhì)組學(xué)方法篩選結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性,并結(jié)合臨床病理信息進(jìn)行分析,初步探討其在肺鱗癌發(fā)生、發(fā)展中的表達(dá)變化。材料與方法:1.研究對(duì)象:組織標(biāo)本:收集22例肺鱗癌患者的癌組織及相應(yīng)的癌旁正常組織,其中Ⅰ期患者6例,Ⅱ期4例,Ⅲ期12例;高分化患者5例,中分化7例、低分化10例。所有肺組織標(biāo)本均經(jīng)過組織病理學(xué)確診。血清標(biāo)本:收集12例Ⅰ期肺鱗癌患者及12例正常體檢人群的血清。2.研究方法:2.1蛋白

4、質(zhì)組學(xué)方法篩選、鑒定早期肺鱗癌相關(guān)蛋白。2.1.1蛋白樣品的處理分別提取6例Ⅰ期肺鱗癌患者癌組織及癌旁正常肺組織的可溶性總蛋白,Bradford方法測(cè)定蛋白樣品濃度,作為分析型和制備型凝膠蛋白上樣量的依據(jù),蛋白樣品應(yīng)用2-D clean-up kit進(jìn)行除雜處理。2.1.2比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析分別將肺鱗癌組和癌旁正常組標(biāo)本等質(zhì)量混合,在優(yōu)化的2-DE條件下,每組混合樣本以分析型蛋白上樣量(11cm pH3~10 IPG膠條)在相同條件下進(jìn)

5、行3次2-DE,硝酸銀染色后得到肺鱗癌分析型雙向電泳凝膠圖譜,用Imagescanner圖像掃描儀獲取凝膠圖像,采用ImageMaster 2D Platinum 6.0圖像分析軟件對(duì)2組的全蛋白質(zhì)組表達(dá)譜進(jìn)行差異分析,分別以各組中2-DE效果好、點(diǎn)數(shù)多的一塊膠作為參考膠,進(jìn)行組間的匹配分析。2.1.3血清學(xué)蛋白質(zhì)組分析方法(SESPA)(11cm pH3~10 IPG膠條),2塊凝膠轉(zhuǎn)膜后分別與肺鱗癌組混合血清及對(duì)照組混合血清孵育,經(jīng)

6、二抗反應(yīng)和DAB試劑盒顯色后獲取肺鱗癌組織與肺鱗癌患者血清及對(duì)照混合血清的Western Blot反應(yīng)圖譜。經(jīng)圖像分析軟件及人工比對(duì),找出NC膜上差異反應(yīng)蛋白點(diǎn)并在平行凝膠上定位。結(jié)合比較蛋白質(zhì)組學(xué)方法所獲取的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)圖譜,選擇二者共有的差異蛋白質(zhì)作為肺鱗癌差異蛋白。2.1.4肺鱗癌相關(guān)蛋白的鑒定將比較蛋白質(zhì)組學(xué)和SERPA得到的共有差異蛋白點(diǎn)從制備型凝膠(17cmpH3~10,IPG膠條)上挖下,膠內(nèi)酶解后,經(jīng)MALDI-TOF-

7、MS和串聯(lián)質(zhì)譜(tandemmass spectrometry,TMS)進(jìn)行分析,獲得肽質(zhì)量指紋圖譜(Peptide MassFingerprint,PMF)或肽序列標(biāo)簽(Peptide Sequence Tag,PST),用Mascot軟件搜索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫,聯(lián)合生物信息學(xué),鑒定差異蛋白質(zhì)性質(zhì),作為肺鱗癌相關(guān)蛋白的候選標(biāo)志。2.2肺鱗癌差異蛋白ANXⅠ、HSP27及Ran的表達(dá)驗(yàn)證。2.2.1基因水平的驗(yàn)證提取肺鱗癌患者癌組織和癌旁正常

8、組織的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以β-actin為內(nèi)參照,采用FQ-PCR方法擴(kuò)增肺鱗癌相關(guān)蛋白ANXⅠ、HSP27及Ran的基因片段,分析轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況及其與患者臨床病理特征的關(guān)系。2.2.2蛋白表達(dá)水平的驗(yàn)證提取肺鱗癌患者癌組織及其癌旁正常組織的可溶性總蛋白,Bradford法測(cè)定樣品的蛋白質(zhì)濃度。取適量樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,將凝膠上分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(NC)膜上,加入特異性一抗和二抗孵育后ECL顯色,以β

9、-actin為內(nèi)參照,檢測(cè)肺鱗癌相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。2.2.3細(xì)胞學(xué)定位鱗癌組織及其癌旁正常組織經(jīng)福爾馬林固定、石蠟包埋,連續(xù)切片。采用過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素(Streptavidin/Peroxidase,SP)免疫組織化學(xué)染色,檢測(cè)肺鱗癌相關(guān)蛋白ANXⅠ、HSP27及Ran的細(xì)胞學(xué)定位及其蛋白表達(dá)情況。3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理利用SPSS12.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用t檢驗(yàn)比較目的基因的表達(dá)差異,卡方檢驗(yàn)比較目的蛋白陽性表達(dá)率的差異

10、,以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。結(jié)果:1.早期肺鱗癌相關(guān)蛋白的篩選和鑒定1.1對(duì)肺鱗癌組和癌旁正常組織組蛋白混合樣品分別進(jìn)行3次2-DE,進(jìn)行組內(nèi)和組間匹配,建立分辨率及重復(fù)性較高的蛋白質(zhì)表達(dá)譜。肺鱗癌組平均匹配蛋白點(diǎn)數(shù)為626個(gè),平均匹配率為87.46%;癌旁正常組平均匹配蛋白點(diǎn)數(shù)為602個(gè),平均匹配率為89.21%。在匹配分析的基礎(chǔ)上篩選出早期肺鱗癌差異蛋白點(diǎn)38個(gè)。1.2建立分辨率及重復(fù)性較高的肺鱗癌組織蛋白混合樣品與肺鱗癌血清和對(duì)照

11、血清的Western Blot圖譜,經(jīng)軟件分析及人工比對(duì)篩選出16個(gè)差異反應(yīng)蛋白點(diǎn),并在轉(zhuǎn)膜后的銀染凝膠和平行膠中找到相對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)點(diǎn)。結(jié)合肺鱗癌組和癌旁對(duì)照組組織蛋白混合樣品的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)圖譜,篩選出10個(gè)二者共有的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)。1.3在制備膠上挖取相應(yīng)的差異蛋白點(diǎn),經(jīng)MALDI-TOF-MS或TMS進(jìn)行分析,獲得PMF或PST,搜索NCBInr蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫,10個(gè)差異蛋白質(zhì)最終鑒定為膜聯(lián)蛋白Ⅰ(annexinⅠ,ANXⅠ)、熱休克蛋

12、白27(heat shock protein 27,HSP27)、ras相關(guān)核蛋白(ras-related nuclear protein,Ran)、Sloo鈣結(jié)合蛋白A9(S100 calcin-binding protein A9,S100A9)、鐵蛋白輕鏈(ferritin lightpolypeptide,FLP)、硫氧還原蛋白過氧化物酶3(peroxiredoxin 3,PRX3)、烯酰輔酶A水合酶1(Enoyl Coenzy

13、me A hydratase l,ECH1)、翻譯延伸因子(elongation factor,EF-Tu)、多聚胞嘧啶結(jié)合蛋白Ⅰ(poly cR binding proteinⅠ,PCBP1)、PWP1相互作用蛋白4(PWP1-interacting protein 4)。2.肺鱗癌相關(guān)蛋白ANXⅠ、HSP27及Ran的表達(dá)驗(yàn)證。2.1ANXⅠ的表達(dá)驗(yàn)證結(jié)果熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示肺鱗癌組織中ANXⅠ基因mRNA的表達(dá)水平是癌旁正

14、常組織中的1.81倍,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。低分化肺鱗癌組織中ANXⅠmRNA的表達(dá)水平高于高、中分化癌組織,ANXⅠ在早期(Ⅰ期+Ⅱ期)肺鱗癌組織和非早期(Ⅲ期)癌組織中mRNA表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Western Blot結(jié)果表明肺鱗癌組織中ANXⅠ的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織,ANXⅠ在低分化肺鱗癌組織中的蛋白表達(dá)水平高于高、中分化癌組織,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

15、ANXⅠ在早期(Ⅰ期+Ⅱ期)肺鱗癌組織和非早期(Ⅲ期)癌組織中蛋白表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。免疫組化結(jié)果顯示ANXⅠ主要定位于胞膜和胞漿,肺鱗癌組織和癌旁正常組織中未發(fā)現(xiàn)陽性定位改變。ANXⅠ在肺鱗癌組織和癌旁正常組織中的總陽性表達(dá)率分別為72.73%(16/22)和31.82%(7/22),強(qiáng)陽性表達(dá)率分別為40.91%和9.09%。與癌旁正常組織相比,ANXⅠ在肺鱗癌組織中的總陽性表達(dá)率和強(qiáng)陽性表達(dá)率顯著增高

16、(P<0.05)。Western Blot和免疫組化結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果有相同的差異趨勢(shì)。2.2HSP27的表達(dá)驗(yàn)證結(jié)果熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示HSP27在肺鱗癌組織和癌旁正常組織中mRNA的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western Blot結(jié)果顯示HSP27在肺鱗癌組織中蛋白表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織(P<0.05),HSP27在低分化肺鱗癌組織中的蛋白表達(dá)水平顯著高于高、中分化癌組織(P<0.05)。HSP2

17、7在早期(Ⅰ期+Ⅱ期)肺鱗癌組織和非早期(Ⅲ期)癌組織中的蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。HSP27陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞胞膜,未發(fā)現(xiàn)肺鱗癌和癌旁正常組織中的陽性定位的變化。HSP27在肺鱗癌組織中的總陽性表達(dá)率為72.27%(17/22),強(qiáng)陽性表達(dá)率為31.82%(7/22);在癌旁正常組織的總陽性表達(dá)率為18.18%(4/22),未發(fā)現(xiàn)強(qiáng)陽性表達(dá)。與癌旁正常組織相比較,HSP27在肺鱗癌中的總陽性表達(dá)率和強(qiáng)陽性

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