激光捕獲顯微切割結(jié)合定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選人肺鱗癌早期診斷標(biāo)志物.pdf

1、肺癌是全球發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。盡管肺癌的診斷和治療水平已大大提高,但病人的生存率仍然很低,五年生存率低于15％。肺癌患者預(yù)后差的主要原因,一方面是由于肺癌發(fā)病機理仍然不是很清楚,另方面是缺乏有效的肺癌早期診斷標(biāo)志物。因此,篩選肺癌早期診斷標(biāo)志物對于提高療效、改善預(yù)后具有重要意義。
　　肺鱗癌起源于支氣管上皮,是一個多基因參與、多階段的復(fù)雜病理學(xué)過程。在致癌因素作用下,支氣管上皮細胞的癌變過程一般要經(jīng)過基底細胞增生、鱗狀化

2、生,進而進展為不典型增生、原位癌,再發(fā)展為浸潤癌。為了篩選新的肺鱗癌早期診斷標(biāo)志物,揭示肺鱗癌癌變的機制,我們首先采用激光捕獲顯微切割(laser capturemicrodissection,LCM)技術(shù)純化正常支氣管上皮組織、鱗狀化生、不典型增生、原位癌、浸潤癌組織,然后再用同位素標(biāo)記相對和絕對定量(iTRAQ)技術(shù)結(jié)合二維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(2D LC-MS/MS)鑒定支氣管上皮癌變過程中各階段的差異表達蛋白質(zhì)。本研究共鑒定了102

3、個差異表達蛋白質(zhì),在這些差異蛋白質(zhì)中,有的在支氣管上皮癌變過程中進行性上調(diào),有的在支氣管上皮癌變過程中進行性下調(diào),有的呈階段特異性改變。分層聚類分析顯示:102個差異表達蛋白質(zhì)聚集成8個簇,3大群。GO功能注釋顯示:第1群差異蛋白質(zhì)主要涉及發(fā)育、凋亡、翻譯和代謝等生物學(xué)過程;第2群差異蛋白質(zhì)主要涉及器官發(fā)育、凋亡、對生物刺激的應(yīng)答和肌動蛋白絲束的形成等生物學(xué)過程;第3群差異蛋白質(zhì)主要涉及代謝、細胞凋亡、運輸、細胞大分子定位、細胞增殖和體

4、液免疫應(yīng)答等生物學(xué)過程。KEGG通路分析顯示:這三群差異蛋白質(zhì)涉及與腫瘤相關(guān)的一些信號通路,如MAPK信號通路,凋亡、細胞周期、p53信號通路、以及ErbB信號通路等。同一群差異蛋白為共同調(diào)節(jié)蛋白,它們在支氣管上皮癌變的過程中可能具有相似的生物學(xué)功能,并可能通過這些信號通路發(fā)揮作用,從而促使支氣管上皮癌變。
　　在102個差異蛋白質(zhì)中,HSPB1的表達在支氣管上皮癌變過程中呈進行性上調(diào),GSTP1和CKB的表達在支氣管上皮癌變過程

5、中呈進行性下調(diào)。因此,我們選擇HSPB1、GSTP1和CKB進行深入研究,采用Western blotting檢測這三個蛋白質(zhì)在支氣管上皮癌變過程中各階段組織中的表達,結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致;采用免疫組織化學(xué)染色檢測這三個蛋白質(zhì)在石蠟包埋的正常支氣管上皮、鱗狀化生、不典型增生、原位癌、浸潤癌組織標(biāo)本中的表達,并且采用ROC曲線分析評估它們早期診斷肺鱗癌的能力,結(jié)果顯示:三個蛋白組合判別正常支氣管上皮和癌前病變的敏感性和特異性分別為96

6、％和92％、判別正常支氣管上皮和肺鱗癌的敏感性和特異性分別為99％和98％、判別癌前病變和肺鱗癌的敏感性和特異性分別為92％和91％,結(jié)果表明:HSPB1、GSTP1和CKB聯(lián)合檢測能區(qū)分正常支氣管上皮、癌前病變和肺鱗癌。
　　為探討GSTP1在肺鱗癌發(fā)病中的作用,我們以永生化的人支氣管上皮細胞株16HBE為研究對象,采用siRNA干擾技術(shù)建立了穩(wěn)定沉默GSTP1表達的16HBE細胞系(16HBE/PLO.1-GSTP1-sNRN

7、A)及空白載體轉(zhuǎn)染的對照細胞系:采用MTT細胞增殖測定、平板集落形成實驗、軟瓊脂集落實驗、流式細胞術(shù)和Hoechest33258染色等觀察GSTP1表達沉默對苯并芘(B[a]P)轉(zhuǎn)化16HBE細胞的影響。結(jié)果顯示:與對照細胞比較,在B[a]P的誘導(dǎo)下,GSTP1表達沉默的16HBE細胞的增殖速度明顯增快、平板集落數(shù)和軟瓊脂集落數(shù)均顯著增加、細胞凋亡率顯著減少。結(jié)果表明:GSTP1表達沉默顯著增加16HBE細胞對B[a]P誘導(dǎo)細胞轉(zhuǎn)化的敏

8、感性。提示GSTP1表達下調(diào)參與了支氣管上皮的癌變,GSTP1表達下調(diào)有望成為預(yù)測吸煙人群對肺鱗癌易感性的指標(biāo)。
　　本研究采用LCM結(jié)合定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)開展支氣管上皮癌變各階段組織的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究,鑒定了102個支氣管上皮癌變相關(guān)的蛋白質(zhì),深入挖掘了102個差異表達蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能以及涉及的信號通路;發(fā)現(xiàn)HSPB1、GSTP1和CKB聯(lián)合檢測對正常支氣管上皮、肺鱗癌癌前病變和肺鱗癌組織具有良好的判別能力,HSPB1、GS