UT-B基因敲除小鼠腦中精氨酸酶Ⅰ的表達變化及炎癥反應的發(fā)生.pdf

1、目的：研究尿素通道蛋白B（Urea transporter B，UT-B）基因敲除小鼠腦中精氨酸酶Ⅰ（ArginaseⅠ, ArgⅠ）的表達變化和炎癥反應的發(fā)生及可能的機制。
　　方法：
　　1.體內實驗采用免疫組織化學法觀察野生型小鼠腦中精氨酸酶I的分布情況；免疫熒光法觀察野生型小鼠和UT-B基因敲除小鼠腦組織中精氨酸酶I與神經(jīng)元、星形膠質細胞共表達特點；蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測UT-B基因敲除小鼠和

2、野生型小鼠腦中ArgⅠ、誘導型一氧化氮合成酶（Inducible nitric oxide synthase，iNOS）和腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factorα，TNF-α）蛋白的表達變化。
　　2.體外實驗模擬 UT-B基因敲除小鼠腦中尿素堆積，利用高濃度(25 mmol/L)尿素刺激人腦微血管內皮細胞(human brain microvascular endothelial cells, HBMECs)

3、，免疫熒光法觀察細胞內TNF-α和iNOS的表達；Western blot檢測高濃度尿素刺激細胞3、6、12和24h后，炎癥因子iNOS、TNF-α、環(huán)氧合酶-2（Cycloxygenase-2，COX-2）和相關信號通路核轉錄因子蛋白（nuclear factor kappa B，NF-κB/p65）、p-p65、腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）、p-AMPK的蛋白表達水平變化；

4、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）和化學法進一步檢測高濃度尿素在不同時間刺激人腦微血管內皮細胞后TNF-α和NO的含量。
　　結果：
　　1.精氨酸酶Ⅰ在小鼠腦組織中分布廣泛，包括大腦皮質（分子層除外）、海馬（主要表達在CA1、CA3亞區(qū)及齒狀回）、丘腦（核團）、腦干神經(jīng)核團、小腦（核團及皮質的顆粒細胞層和梨狀細胞層）、第三腦室和脈絡叢等。ArgⅠ陽性表達產物主要在神經(jīng)元的胞體和樹突，少量表達在神經(jīng)膠質細胞。
　　2.與野生

5、型小鼠相比，UT-B基因敲除小鼠腦組織中標記神經(jīng)元的NeuN陽性熒光強度明顯減弱。
　　3.與野生型小鼠相比，UT-B基因敲除小鼠海馬中ArgⅠ蛋白表達水平下降（P<0.05），而iNOS和TNF-α蛋白表達水平明顯升高（P<0.01）。
　　4.高濃度(25mmol/L)尿素刺激人腦微血管內皮細胞不同時間后，細胞中TNF-α、COX-2、p-p65和p-AMPK蛋白表達水平在3和6h明顯高于對照組（P<0.05）；iNOS

6、蛋白表達水平在24h內則持續(xù)增高（P<0.05）；NO含量在3h明顯增多（P<0.05）。
　　結論：
　　1.野生型小鼠腦組織中精氨酸酶I分布廣泛，且主要表達在神經(jīng)元上，少量表達在神經(jīng)膠質細胞。
　　2.UT-B基因敲除小鼠與野生型小鼠比較，腦組織中神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，且精氨酸酶I含量隨神經(jīng)元數(shù)目減少而減少。除此之外，UT-B基因敲除小鼠腦組織中相關炎癥因子iNOS和 TNF-α蛋白表達水平增高，提示UT-B基因敲除