UT-B基因轉(zhuǎn)染對(duì)5-6腎切除大鼠腎功能的影響.pdf

1、目的：構(gòu)建包含大鼠尿素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白B（urea transporter B，UT-B）基因的重組腺病毒載體，研究UT-B基因轉(zhuǎn)染對(duì)Caco-2細(xì)胞中UT-B mRNA和蛋白的表達(dá)及尿素轉(zhuǎn)運(yùn)功能的影響；構(gòu)建大鼠5/6腎切除腎衰模型，研究經(jīng)腸道給予重組腺病毒載體對(duì)大鼠結(jié)腸組織 UT-B mRNA及蛋白的表達(dá)及血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）水平的影響，為腎功能不全尋找新的基因治療手段。
　　方法：取SD大鼠腎髓質(zhì)

2、，抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增大鼠UT-B基因的CDS區(qū)全長片段，PCR產(chǎn)物連接至pMD-18T克隆載體，分別以克隆載體pMD18-UT-B和IRES2-EGFP質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增UT-B和IRES-EGFP序列，通過引物重疊區(qū)進(jìn)行PCR拼接，并在UT-B-IRES-EGFP兩端引入attB1、attB2重組臂序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)BP重組系統(tǒng)將UT-B-IRES-EGFP融合基因重組到入門載體 pDO

3、NR221中，構(gòu)建入門克隆。入門克隆與表達(dá)載體pAd/CMV/V5-DEST使用 LR重組系統(tǒng)進(jìn)行體外重組，構(gòu)建表達(dá)克隆pAd-UT-B-IRES-EGFP，pAd-UT-B-IRES-EGFP轉(zhuǎn)化DH-5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，PCR及測(cè)序驗(yàn)證。pAd-UT-B-IRES-EGFP用 Pac I酶切線性化后由Lipofectamine2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，包裝病毒，收集病毒液并測(cè)定滴度。重組的腺病毒體外感染培養(yǎng)的Caco-

4、2細(xì)胞，以含有EGFP但無UT-B的腺病毒空載體為對(duì)照，RT-PCR檢測(cè)Caco-2細(xì)胞中UT-B mRNA的表達(dá)，Western blot檢測(cè)UT-B蛋白表達(dá)，以14C同位素標(biāo)記法測(cè)定Caco-2細(xì)胞尿素轉(zhuǎn)運(yùn)功能。構(gòu)建5/6腎切除大鼠腎功能不全動(dòng)物模型，經(jīng)腸道給予pAd-UT-B-IRES-EGFP載體，以含有EGFP但無UT-B的腺病毒空載體為對(duì)照，檢測(cè)大鼠腸組織UT-B mRNA和蛋白表達(dá)及血BUN水平。
　　結(jié)果：成功克隆

5、了大鼠UT-B基因，構(gòu)建了pAd-UT-B-IRES-EGFP載體，經(jīng)PCR及測(cè)序驗(yàn)證，該表達(dá)載體包含UT-B基因，且序列與GeneBank中收錄的大鼠UT-B序列一致。重組的腺病毒感染培養(yǎng)的Caco-2細(xì)胞24h后，可檢測(cè)到UT-B mRNA及UT-B蛋白的表達(dá)明顯增強(qiáng)（P<0.05），同時(shí)尿素轉(zhuǎn)運(yùn)效率增加（P<0.05）。大鼠5/6腎切除8周后 BUN明顯增高（P<0.01），經(jīng)腸道給予pAd-UT-B-IRES-EGFP載體后，大