鼠衣原體肺部二次感染中NK細(xì)胞對免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、衣原體（Chlamydia）是一種嚴(yán)格胞內(nèi)寄生的原核細(xì)胞型微生物，其中沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis）感染可引起機體多種感染性疾病，如:生殖道感染引起的輸卵管炎、不育癥，呼吸道感染引起的肺炎、支氣管炎，以及眼部粘膜感染引起的沙眼。沙眼農(nóng)原體感染是一個長期慢性的過程，機體產(chǎn)生的細(xì)胞免疫反應(yīng)強度如果不足以徹底清除細(xì)胞內(nèi)寄生的衣原體，易形成持續(xù)性感染與組織病理損傷。在機體應(yīng)對沙眼衣原體感染時，CD4+T細(xì)胞起主導(dǎo)性保護(hù)

2、作用，產(chǎn)生的多種Th1類細(xì)胞因子，如:IFN-γ、IL-2、TNF-α，在沙眼衣原體生殖道和肺部感染中均發(fā)揮重要的抗感染作用。其中IFN-γ除可直接抑制衣原體復(fù)制外，還對適應(yīng)性免疫細(xì)胞起重要調(diào)節(jié)作用。B細(xì)胞以及衣原體特異性抗體也具有一定的保護(hù)性作用，并與CD4+T細(xì)胞有協(xié)同作用，而CD8+T細(xì)胞在抗沙眼衣原體感染中的作用比較微弱。
　　自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞是機體固有免疫系統(tǒng)的重要成員，在抵抗病原體感染

3、中發(fā)揮重要作用。NK細(xì)胞的活化是其表面的活化和抑制性受體相互作用，共同介導(dǎo)完成的。NK細(xì)胞抗感染免疫功能的發(fā)揮主要依靠兩條途徑實現(xiàn):1.通過識別被感染細(xì)胞，直接殺傷靶細(xì)胞;2.通過IFN-γ、IL-2等細(xì)胞因子的分泌，以及與DC的相互作用，募集和調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫細(xì)胞的應(yīng)答，抑制病原體的擴增。NK細(xì)胞殺傷能力和細(xì)胞因子分泌能力的激活依賴于其所處的細(xì)胞因子微環(huán)境，以及與免疫系統(tǒng)其他細(xì)胞的相互作用。傳統(tǒng)意義上，NK細(xì)胞主要在初次感染的早期應(yīng)答中

4、發(fā)揮作用。最近有報道證實，NK細(xì)胞在病原體二次感染（如:結(jié)核桿菌、呼吸道合胞病毒）引起的機體免疫應(yīng)答中也發(fā)揮重要作用。
　　我們前期工作發(fā)現(xiàn)，衣原體感染可以激活NK細(xì)胞;在小鼠衣原體肺部初次感染中，NK細(xì)胞可通過調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞亞群的分化，進(jìn)而發(fā)揮抗感染的免疫保護(hù)作用。小鼠體內(nèi)NK細(xì)胞清除后，衣原體肺部感染加重，免疫保護(hù)性的Th1和Th17類細(xì)胞數(shù)量減少，免疫抑制性的Treg細(xì)胞數(shù)量增多。
　　本文在以上工作基礎(chǔ)上，進(jìn)一步

5、探討了NK細(xì)胞在衣原體肺部二次感染中發(fā)揮的作用及其免疫機制。
　　一、小鼠肺部衣原體二次感染模型建立和二次感染小鼠體內(nèi)T細(xì)胞應(yīng)答特點
　　目的:探討與一次感染相比，衣原體肺部二次感染后，主要CD4+T細(xì)胞亞群的應(yīng)答特點。方法:C57BL/6小鼠滴鼻吸入含鼠肺炎衣原體（Chlamydiamuridarum）的感染液，建立小鼠肺部一次感染;一次感染后6-8周（感染已完全恢復(fù)），小鼠再次滴鼻感染建立小鼠肺部二次感染模型。采用同齡小

6、鼠初次滴鼻感染，作為一次感染組。記錄體重繪制體重變化曲線;間接計數(shù)法檢測小鼠肺部包涵體形成單位(IFUs)數(shù)量;流式細(xì)胞術(shù)檢測兩組小鼠體內(nèi)主要CD4+T細(xì)胞亞群Th1、Treg細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果:與一次感染組相比，二次感染組小鼠的體重降低趨勢明顯減輕，肺部IFUs明顯降低，疾病恢復(fù)進(jìn)程加快;細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色結(jié)果顯示，感染后6天，二次感染組小鼠的脾、縱膈淋巴結(jié)和肺組織中IFN-γ+CD4+T細(xì)胞（即Th1細(xì)胞）均顯著增多。Foxp3+CD2

7、5+CD4+T細(xì)胞（即Treg細(xì)胞）在一次感染和二次感染后均有擴增，但兩組間沒有明顯數(shù)量差異。結(jié)論:成功建立小鼠二次肺部感染模型;在衣原體二次感染中，Th1細(xì)胞迅速激活并擴增，是疾病迅速恢復(fù)的主要免疫機制。
　　二、NK細(xì)胞在小鼠肺部衣原體二次感染中的作用及機制
　　目的:探討NK細(xì)胞在衣原體肺部二次感染中的作用及機制。方法:采用小鼠肺部衣原體二次感染模型，實驗組小鼠在二次感染的-2、-1、1、3、5天分別尾靜脈注射anti

8、-asialo GM1 NK細(xì)胞中和抗體以清除體內(nèi)NK細(xì)胞，二次感染對照組小鼠在同時間點注射同型抗體。體重記錄繪制體重變化曲線;間接計數(shù)法檢測小鼠肺部IFUs; ELISA技術(shù)檢測脾、縱膈淋巴結(jié)、肺中單個核細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ分泌量;流式細(xì)胞術(shù)檢測兩組小鼠體內(nèi)（脾、縱膈淋巴結(jié)、肺）Th1、Treg細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果:注射anti-asialoGM1抗體使小鼠體內(nèi)NK細(xì)胞得到有效清除，二次感染后4天肺中NK細(xì)胞封閉效果可達(dá)到90.5％。二

9、次感染后，與同型對照組相比，NK細(xì)胞清除組小鼠肺部IFUs數(shù)量均增多，且感染后3天差異更加顯著。二次感染后NK細(xì)胞清除并沒有對小鼠體重下降造成明顯影響。感染后6天，與對照組相比，NK細(xì)胞清除組小鼠脾、縱膈淋巴結(jié)及肺中單個核細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ分泌量均顯著減少;NK細(xì)胞清除組小鼠的脾、淋巴結(jié)及肺中Th1細(xì)胞亞群在CD4+T細(xì)胞中所占比例均有所減少，但Treg細(xì)胞亞群比例有所增高。在衣原體二次感染中，NK細(xì)胞的清除對體內(nèi)衣原體特異性Ig

10、G、IgG2a、IgG1的產(chǎn)生無明顯影響。說明NK細(xì)胞清除使二次感染小鼠肺部的衣原體載菌量增加，并在一定程度上削弱了機體Th1細(xì)胞應(yīng)答，增強了Treg細(xì)胞應(yīng)答。結(jié)論:在衣原體肺部二次感染中，NK細(xì)胞仍發(fā)揮一定的免疫保護(hù)作用，其機制可能與其通過免疫調(diào)節(jié)作用促進(jìn)Th1細(xì)胞增殖，抑制Treg細(xì)胞應(yīng)答有關(guān)。
　　綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn):1）衣原體肺部二次感染后，小鼠體內(nèi)Th1細(xì)胞亞群顯著擴增，但Treg細(xì)胞亞群沒有明顯變化。提示Th1細(xì)胞免

11、疫應(yīng)答的增強是二次感染疾病恢復(fù)進(jìn)程加快的主要原因。2）二次感染后NK細(xì)胞清除組小鼠肺部衣原體載菌量增多，但小鼠體重變化差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義。3）二次感染后NK細(xì)胞清除組小鼠體內(nèi)（脾、淋巴結(jié)、肺）分泌IFN-γ水平下降、Th1細(xì)胞的比例減少、Treg細(xì)胞的比例增高。證明在衣原體肺部二次感染中，NK細(xì)胞發(fā)揮一定的抗感染保護(hù)作用，其可通過促進(jìn)Th1細(xì)胞增殖、抑制Treg細(xì)胞應(yīng)答，加強機體對衣原體的清除。該研究加深了對衣原體感染免疫機制的認(rèn)識，