GHSR在同種器官移植急性排斥反應(yīng)中的作用及細(xì)胞分子機(jī)制研究.pdf

1、研究背景及目的:對于許多實(shí)體器官終末期疾病及腫瘤、血液疾病來說，器官移植或者造血干細(xì)胞移植已成為一種重要的治療手段。隨著免疫抑制劑的發(fā)明和廣泛應(yīng)用，大部分移植排斥反應(yīng)得到了有效控制，移植物的長期存活率得到了明顯提升。但仍有相當(dāng)一部分移植排斥反應(yīng)控制效果不佳，導(dǎo)致移植物功能障礙或衰竭，嚴(yán)重者甚至導(dǎo)致二次移植或者宿主死亡。因此，關(guān)于移植排斥反應(yīng)的研究仍在如火如荼的進(jìn)行中。
　　急性移植排斥反應(yīng)是同種異體器官移植中最常見的一類排斥反應(yīng)，

2、一般多于移植術(shù)后數(shù)天至兩周左右出現(xiàn)，80-90％發(fā)生于術(shù)后一個(gè)月內(nèi)，也有相當(dāng)一部分受者在移植術(shù)后相當(dāng)長一段時(shí)間內(nèi)反復(fù)發(fā)作。而T細(xì)胞免疫應(yīng)答在移植排斥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用乃是全世界公認(rèn)的事實(shí)。其中，在急性移植排斥反應(yīng)中，CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)是主要的損傷機(jī)制。T細(xì)胞可通過直接識別和間接識別對同種異型抗原進(jìn)行識別。移植物中的過客白細(xì)胞（passenger leukocytes，主要為成熟的DC和巨噬細(xì)胞等APC）可進(jìn)入受體的血液循

3、環(huán)及淋巴組織，在外周淋巴組織與外周淋巴器官中（主要是淋巴結(jié)和脾臟）與受體的T細(xì)胞接觸后可通過直接識別(direct recognition)將同種移植抗原直接遞呈給受體T細(xì)胞，以快速活化T淋巴細(xì)胞;或通過間接識別(indirect recognition)的方式將同種MHC抗原提呈給受體T細(xì)胞，介導(dǎo)T細(xì)胞活化的免疫應(yīng)答過程，產(chǎn)生機(jī)體針對移植物的移植排斥反應(yīng)。
　　器官移植后的免疫應(yīng)答過程復(fù)雜，不同的免疫細(xì)胞及其亞群的活化、細(xì)胞與細(xì)

4、胞的相互作用及其信號調(diào)控、分泌的細(xì)胞因子以及神經(jīng)-內(nèi)分泌均在移植排斥反應(yīng)的產(chǎn)生中發(fā)揮調(diào)控作用，包括(1)細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是近年來認(rèn)識的發(fā)揮重要調(diào)控作用的細(xì)胞。研究表明，CD4+CD25+Treg可通過細(xì)胞直接接觸（包括CTLA-4、PDL-1等分子結(jié)合）的方式，調(diào)控T細(xì)胞的增殖，并可下調(diào)共刺激分子，抑制T細(xì)胞活化。(2)細(xì)胞因子對細(xì)胞的調(diào)控。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞大體上可分為CD4+CD25+Tr細(xì)胞、Tr1細(xì)胞、Th3細(xì)胞

5、等亞型。CD4+Th2細(xì)胞活化后可分泌IL-10，誘導(dǎo)Tr1細(xì)胞生成，Tr1細(xì)胞活化后也可分泌IL-10。而Th3細(xì)胞分泌TGF-β，則對CD4+Th1、Th2都有抑制作用。(3)神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)T細(xì)胞的分化。有研究表明，GH缺陷時(shí)CD4+ CD8+雙陽性胸腺細(xì)胞減少，GH還影響胸腺細(xì)胞的遷移和釋放。體外注射T3則能增加CD44+胸腺細(xì)胞的數(shù)量。生長激素促分泌素受體（GHSR），也是胃饑餓素的受體，首先是作為生長激素促分泌素（GHS）的靶

6、受體被發(fā)現(xiàn)，隨即在人類腦垂體和下丘腦中發(fā)現(xiàn)其存在。Zigman JM等發(fā)現(xiàn)GHSR在中樞和外周組織中均有廣泛表達(dá)。GHSR的生理功能包括:(1)與多種激素的釋放有關(guān)，如生長激素，促腎上腺皮質(zhì)激素，皮質(zhì)醇，催乳素;(2)調(diào)節(jié)食物攝入和能量代謝;(3)影響血糖和血脂代謝;(4)調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動和分泌和胰腺功能;(5)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和存活;(6)在衰減促炎癥級聯(lián)反應(yīng)和調(diào)節(jié)老化和胃腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的免疫功能作用;(7)保護(hù)神經(jīng)和心血管系統(tǒng)。

7、但是，GHSR是否在移植排斥的產(chǎn)生和調(diào)控過程中發(fā)揮重要的作用，目前尚未有相關(guān)研究的報(bào)道。
　　基于此，本研究在通過構(gòu)建GHSR缺陷小鼠，研究GHSR在不同免疫細(xì)胞中的表達(dá)，探討GHSR對免疫細(xì)胞增殖的影響。在建立小鼠心臟同種異體異位移植模型的基礎(chǔ)上，研究GHSR在急性移植排斥中的作用及體內(nèi)細(xì)胞與分子機(jī)制。為GHSR闡述GHSR在同種移植排斥的作用、更有效的防治移植排斥反應(yīng)提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　第一部分:小鼠頸部心臟同種異體移植

8、模型的建立及GHSR在急性移植排斥反應(yīng)中的作用
　　目的:建立小鼠頸部心臟同種異體移植后急性排斥反應(yīng)模型并研究GHSR在急性移植排斥反應(yīng)中的作用。
　　方法:1）、選取6周齡的體重、性別相匹配的Balb/c小鼠作為供體，8周齡的體重、性別相匹配的GHSR-/-（實(shí)驗(yàn)組）和C57（對照組）小鼠作為受體，行頸部異位心臟移植術(shù)。2）、觀察其移植物生存期。3）、術(shù)后第5天取移植物行病理檢查（HE染色）。4)、用RT-PCR檢測術(shù)后移

9、植物中炎癥因子IL-1、6、17、TNF-a的mRNA表達(dá)的變化。5)、流式細(xì)胞術(shù)檢測術(shù)后受體小鼠脾臟、淋巴結(jié)中T細(xì)胞亞群的變化。
　　結(jié)果:GHSR缺陷可明顯延長移植物生存期;HE染色顯示實(shí)驗(yàn)組小鼠心肌細(xì)胞水腫、壞死、炎癥細(xì)胞浸潤等較對照組明顯減輕;實(shí)驗(yàn)組小鼠移植后移植物各炎癥因子的表達(dá)均低于對照組;其脾臟及淋巴結(jié)內(nèi)的CD4+T細(xì)胞比例也低于較對照組，Treg細(xì)胞比例均高于對照組。
　　結(jié)論:GHSR缺陷后可減輕急性移植排

10、斥反應(yīng)，對移植物發(fā)揮保護(hù)作用。
　　第二部分: GHSR在同種器官移植急性排斥反應(yīng)中的細(xì)胞分子機(jī)制研究
　　目的:研究GHSR在急性移植排斥反應(yīng)中的作用機(jī)制。
　　方法:1）、免疫組化分析移植物中浸潤的細(xì)胞種類。2）、RT-PCR檢測移植物中細(xì)胞表面分子mRNA的表達(dá);3）、混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)檢測兩組小鼠T細(xì)胞增值能力的變化。4）、Western-blot檢測T細(xì)胞激活通路中NF-κB通路中關(guān)鍵蛋白的變化。5）、West

11、ern-blot檢測NF-AT、AP-1、Foxp3蛋白的變化。
　　結(jié)果:免疫組化顯示移植物的浸潤細(xì)胞以T細(xì)胞為主，但GHSR缺陷的小鼠的T細(xì)胞數(shù)量明顯低于對照組;GHSR缺陷小鼠的T細(xì)胞增值能力較C57BL/6小鼠減弱;實(shí)驗(yàn)組小鼠移植后NF-κB通路中ZAP-70、IKKβ、p65蛋白活化均低于對照組;在GHSR缺陷的小鼠中，由于NF-AT和AP-1表達(dá)增加，上調(diào)了Foxp3的表達(dá)，使Treg比例增加。
　　結(jié)論:GHS