同種移植急性排斥反應中Pim2的作用及機制研究.pdf

1、研究目的
　　 器官移植目前已成為治療多種終末期疾病的的有效手段。然而發(fā)生于移植術后的數周或數月的急性排斥反應仍是導致治療失敗的主要因素。因此器官移植術的成敗在很大程度上取決于對急性移植排斥反應的防治。既往研究表明T細胞，尤其是CD4+T細胞介導的細胞免疫應答在移植排斥反應的效應機制中發(fā)揮關鍵作用。T細胞存活的信號通路主要包括AKT(also known as protein kinase B，PKB)-mTOR(mammali

2、an Target of Rapamycin)信號通路和Pim(Proviralintegration site of murine)激酶信號通路。既往研究表明，在細胞因子或抗原激活的T細胞信號通路中，T細胞的生長及存活不完全依賴AKT-mTOR通路，阻斷AKT-mTOR信號通路雖可部分抑制T細胞激活，但不能完全阻斷;Pim激酶信號通路可作為選擇性通路。但是有關Pim激酶信號通路在同種反應性T細胞的作用尚未見報道。推測同時阻滯這兩條信號

3、通路，有可能更好地抑制移植受者同種反應性T細胞介導的急性排斥，有利于誘導長期移植耐受。已知CD4+T細胞可分為CD4+CD25-效應T細胞和CD4+CD25+Foxp3+調節(jié)性T細胞(Treg)兩種亞群。其中同種抗原特異性Treg可通過抑制效應T細胞的激活、增殖和促進其凋亡，誘導移植物長期耐受。近來有研究報道Treg細胞可在雷帕霉素(Rapamycin，RAPA)的作用下優(yōu)勢擴增并能很好地保持其抑制功能;而自然調節(jié)性Treg中Foxp3

4、基因能夠誘導pim2基因的表達。以上研究提示pim2與Treg細胞功能密切相關。本實驗室前期研究中，應用SAGE(sequencing-based serialanalysis of gene expression，序列基因表達分析)技術建立了同種移植及同系移植組CD4+T細胞mRNA標簽庫，分析發(fā)現pim2基因在同種移植急性排斥組明顯高表達，是同系移植組表達量的5倍，進一步提示pim2在同種移植急性排斥中具有重要作用。
　　

5、Pim家族是原癌基因編碼三種絲/蘇氨酸激酶，包括Pim1，Pim2 and Pim3，屬于鈣調蛋白依賴性蛋白激酶且在序列上具有很高的同源性。pim2基因位于X染色體上(Xp11)，編碼三種分子量的蛋白質(34kD，37 kD和40 kD)。Pim激酶缺乏調節(jié)結構域，不需磷酸化激活?？赡苁欠g后組成性激活。Pim激酶由轉錄翻譯和蛋白體降解調控。STAT(Signal transducers and activators oftranscr

6、iption，信號傳導及轉錄激活因子)通過與其同源配體銜接而成為pim基因的轉錄因子。Pim蛋白激酶活性依賴于mRNA穩(wěn)定性，Pim通過與SOCS（Suppressor of cytokine signaling，細胞因子信號抑制物）結合從而抑制JAK(Janus Kinase)/STAT信號。多項研究表明Pim激酶通過調控信號轉導在許多生理病理過程中發(fā)揮重要作用，包括細胞周期、轉錄因子、細胞凋亡以及細胞代謝和蛋白質翻譯。在許多造血系統(tǒng)

7、惡性疾病及實體腫瘤中均發(fā)現pim原癌基因的高表達（尤其是Pim1和Pim3），并與腫瘤細胞生長存活及化療藥物抵抗密切相關。據報道目前有幾種Pim特異小分子抑制劑正用于腫瘤治療臨床前期實驗。盡管已有pim2通路在造血系統(tǒng)腫瘤和實體腫瘤中作用的研究報道，但是有關pim2在同種移植急性排斥中的作用及分子機制尚未見報道。Pim2與CD4+T細胞，尤其是Treg密切相關，有可能作為誘導移植免疫耐受的靶向分子;此外Pim2靶向小分子化合物正在研制中

8、，因此Pim2有可能作為同種移植急性排斥診斷和治療的分子靶點。
　　 綜上所述，本論文的科學假設是:pim2可能通過靶向CD4+T細胞的凋亡和調節(jié)CD4+Treg增殖及抑制，在同種移植急性排斥反應過程中發(fā)揮重要作用。本論文研究目的是試圖闡明Pim2激酶在同種移植急性排斥反應中的作用及分子機制，從而為靶向Pim2誘導誘導移植免疫耐受提供理論和實驗依據，為臨床器官移植排斥的治療提供新的靶點，因此具有重要的理論和實際意義。
　　

9、 第一部分Pim2在小鼠同種皮膚移植急性排斥反應中的動態(tài)表達
　　 研究方法
　　 1、建立小鼠同種皮膚移植模型
　　 無菌條件下將C57BL/6小鼠背部全厚度皮膚移植到BALB/c小鼠背部即為同種移植;將BALB/c小鼠的背部全厚度皮膚移植到BALB/c小鼠背部即為同系移植，以此作為對照組。
　　 2、分析pim2基因在排斥高峰時的表達狀況
　　 移植術后14天左右，同種移植皮片完全排斥而同系

10、移植存活完好。利用RT-PCR技術分別檢測兩組小鼠脾細胞、脾CD4+T細胞及移植皮片中的pim2基因表達。
　　 3、同種排斥組與同系對照組的脾臟和移植皮片的病理學表現以及Pim2蛋白的原位表達
　　 通過病理組織切片HE染色及抗Pim2抗體對組織切片的免疫組化染色進一步比較同種排斥組與同系對照組的脾臟和移植皮片的病理學表現差異以及Pim2蛋白原位表達差異情況。
　　 4、Pim2蛋白在同種移植排斥反應過程中的動

11、態(tài)表達情況
　　 移植后不同時間，取受體小鼠的脾及移植皮片，Western Blot檢測Pim2蛋白表達狀況。
　　 研究結果
　　 1、pim2 mRNA在同種移植組的CD4+T細胞、脾臟和移植皮片中的表達水平均明顯高于同系對照組;而且在同種移植組中，pim2 mRNA在脾臟中的的表達水平高于移植皮片，但是同系對照組中二者之間無明顯差異。結果提示:同種移植急性排斥反應較強時，pim2基因高表達，pim2基因是同

12、種移植急性排斥反應正相關基因。
　　 2、與同系對照組相比，同種排斥組的脾和移植皮片均發(fā)生明顯組織病理改變，細胞浸潤明顯; Pim2蛋白高表達于同種排斥組的脾和移植皮片的細胞質中，但同系對照組脾和移植皮片中表達微弱或不表達。結果提示Pim2激酶參與同種急性排斥反應所導致的移植物損害和組織損傷過程。
　　 3、Western Blot結果顯示同種移植術后Pim2蛋白的動態(tài)表達趨勢與同種移植急性排斥反應的發(fā)生過程幾乎完全一致

13、，即脾或移植皮片中的Pim2蛋白表達量隨著同種急性排斥反應的增強而升高。該結果進一步提示Pim2蛋白激酶參與同種移植急性排斥反應并參與對移植物的排斥。
　　 第二部分抑制pim2基因表達對延長同種移植中移植物存活的影響
　　 第一部分研究證實pim2在同種移植急性排斥期高表達，因此本部分進一步研究抑制Pim2后對同種移植排斥的效應及作用機制。
　　 研究方法
　　 1、確定pim抑制劑4a對pim2抑制的

14、最適濃度和時間
　　 首先制備野生型BALB/c小鼠脾細胞懸液，然后將該脾細胞分別與不同濃度的Pim抑制劑4a混合，培養(yǎng)不同時間，最后利用RT-PCR檢測4a處理后脾細胞中pim2基因的表達水平并以pim2 mRNA相對灰度值最低來確定Pim抑制劑4a對pim2抑制的最適濃度和時間。
　　 2、T細胞中的pim2被4a抑制后對T細胞介導的同種移植急性排斥的影響
　　 將B6小鼠的全厚度皮膚移植到SCID（Seve

15、re Combined Immunodeficiency，嚴重聯(lián)合免疫缺陷）小鼠背部而建立SCID小鼠移植模型，3周左右移植皮片愈合，生長完好。此時將預先經過4a或DMSO（對照）體外處理的野生型BALB/c小鼠脾臟T細胞通過腹腔注射過繼到上述已行移植術的SCID鼠體內，構建同種移植急性排斥反應模型，T細胞過繼后，每天觀察兩組移植皮片的生存狀況直至對照組移植皮片排斥。
　　 3、pim2對同種移植急性排斥反應中的同種反應性T細胞

16、的作用及通路
　　 利用T細胞分離柱分離純化出同種移植排斥高峰期小鼠脾臟T細胞，然后利用Pim特異抑制劑4a體外處理24h，利用流式細胞術分析T細胞的凋亡率。采用WesternBlot方法檢測4a對同種反應性T細胞中磷酸化BAD(Ser112)的影響。
　　 4、同種移植急性排斥高峰期脾CD4+CD25-T細胞和CD4+CD25+T細胞中pim2mRNA的表達狀況
　　 利用免疫磁珠分選法分離出同種移植排斥高峰期

17、BALB/c小鼠脾CD4+CD25-T細胞和CD4+CD25+T細胞兩個亞群，然后利用RT-PCR方法檢測兩群細胞中pim2mRNA的表達狀況。
　　 研究結果
　　 1、 pim2 mRNA的表達量與4a呈劑量依賴關系，但非時間依賴關系。最終選定5M4a和24h作為4a對pim2抑制的最適濃度和最適作用時間。
　　 2、4a處理組小鼠移植皮片的平均生存時間約為31.2±2.3天，而DMSO對照組小鼠移植皮片的平

18、均生存時間約為19.5±1.7天。與對照組比較，4a處理組同種移植物生存期明顯延長約12天(P＜0.05)，而且其脾臟重量和大小明顯減小。結果表明4a通過阻滯T細胞中的pim2，明顯延長了同種移植物存活，降低了受體對同種移植物的排斥，提示pim2通過T細胞介導了對同種移植物的急性排斥。
　　 3、4a處理組的T細胞凋亡率明顯升高，與對照組有顯著差異，P＜0.05，提示阻滯T細胞中的pim2，增加了同種反應性T細胞的凋亡;4a處理

19、組的BAD(Ser112)磷酸化水平明顯降低，提示4a通過降低Pim2激酶的下游通路BAD(Ser112)磷酸化水平誘導同種反應性T細胞的凋亡，從而部分阻斷由同種反應性T細胞介導的針對移植物的特異性免疫應答。結果提示:Pim2通過磷酸化BAD Ser112位點發(fā)揮抗同種反應性T細胞凋亡作用，進而介導對同種移植物的急性排斥。
　　 4、在同種移植排斥高峰期，pim2基因在CD4+CD25-T細胞中高表達，約為CD4+CD25+T細

20、胞中pim2基因含量的兩倍，提示pim2優(yōu)勢介導同種反應性CD4+CD25-T細胞的存活，從而發(fā)揮增強同種移植急性排斥的作用。
　　 第三部分Pim2對同種抗原誘導的CD4+CD25+Treg細胞活性的影響
　　 前兩部分研究證明pim2增強同種移植急性排斥反應，但是結果提示同種移植急性排斥中pim2在CD4+CD25+Treg中也有表達，因此不能排除pim2對CD4+CD25+Treg細胞的影響。為此，本部分研究了pi

21、m2對同種抗原誘導的CD4+CD25+Treg細胞活性的影響:
　　 研究方法
　　 1、pim2抑制對CD4+CD25+Treg細胞關鍵轉錄因子Foxp3的影響
　　 利用T細胞分離柱純化分離同種移植急性排斥反應高峰期小鼠脾T細胞，與5M4a混合培養(yǎng)24h后，采用RT-PCR方法檢測細胞Foxp3 mRNA的變化。
　　 2、pim2抑制對CD4+CD25+T細胞抑制功能的影響
　　 利用免疫磁

22、珠分選方法分離出同種移植排斥高峰期BALB/c小鼠脾臟中的CD4+CD25-T細胞和CD4+CD25+T細胞。先將CD4+CD25+T細胞與4a體外共同培養(yǎng)24h，然后再與CD4+CD25-T細胞按照1∶6的比例混合培養(yǎng)12h，最后利用流式細胞術分析CD4+CD25-T細胞的凋亡率。
　　 3、Pim2激酶對雷帕霉素選擇性擴增Foxp3+Treg細胞的影響
　　 建立BALB/c小鼠同種移植模型，移植術后第1天開始每天腹

23、腔注射雷帕霉素，放線菌酮，或雷帕霉素+放線菌酮，同時設生理鹽水注射對照組。直至對照組小鼠移植皮片發(fā)生排斥時停止注射。此時收集不同處理組小鼠脾細胞，利用流式細胞術分析細胞表面的CD4、CD25及細胞質中的Foxp3，以此確定CD4+CD25+Foxp3+Treg所占總細胞比例的變化。隨后，將純化出的雷帕霉素組和聯(lián)合藥物組CD4+CD25+Foxp3+T細胞與Pim2單克隆抗體或4a在體外共培養(yǎng)12h，流式細胞術分析抑制Pim2對CD4+C

24、D25+Foxp3+Treg細胞比例的影響。
　　 研究結果
　　 1、4a在抑制同種反應性T細胞中pim2表達的同時，也降低了Foxp3的基因表達水平，表明阻滯pim2能夠降低同種抗原誘導的CD4+CD25+Foxp3+T細胞的增殖活化。結果提示Pim2激酶對同種抗原誘導的CD4+CD25+Foxp3+T細胞的增殖活化是必要的。
　　 2、4a顯著降低同種抗原誘導的CD4+CD25+Foxp3+T細胞誘導效應性

25、CD4+CD25-T細胞凋亡的能力，表明阻滯pim2降低了CD4+CD25+Foxp3+T細胞的抑制功能，提示Pim2激酶對同種抗原誘導的CD4+CD25+Foxp3+T細胞的抑制功能也是必要的。
　　 3、與對照組相比，雷帕霉素組和聯(lián)合藥物組小鼠脾CD4+CD25+Foxp3+T細胞比例明顯升高，而同種反應性CD4+T細胞比例卻顯著下調，提示在同種移植模型中，雷帕霉素選擇性擴增CD4+CD25+Foxp3+T細胞。抗Pim2單

26、克隆抗體或4a都明顯下調了雷帕霉素組和聯(lián)合藥物組CD4+CD25+Foxp3+T細胞的比例。結果提示在同種移植模型中，阻滯Pim2激酶可明顯降低CD4+CD25+Foxp3+T細胞在雷帕霉素的作用下的擴增水平，提示Pim2激酶對雷帕霉素選擇性擴增同種抗原誘導的CD4+CD25+Foxp3+T細胞同樣是必要的。
　　 第四部分放線菌酮抑制同種移植急性排斥及與Pim2的相關性研究
　　 鑒于文獻報道放線菌酮可以抑制Pim激酶

27、活性，因此推測放線菌酮可能通過抑制Pim激酶抑制急性同種移植排斥。
　　 研究方法
　　 1、放線菌酮對pim2表達的影響
　　 為探索放線菌酮抑制pim2的最適濃度，利用小鼠T細胞分離柱從野生型BALB/c小鼠脾細胞中分離純化T細胞，分別與不同濃度的放線菌酮混合培養(yǎng)24h，最后利用RT-PCR分析藥物處理后T細胞中pim2基因的表達并以pim2mRNA相對灰度值來確定放線菌酮抑制pim2的最適濃度。
　　

28、 2、放線菌酮體外阻滯T細胞pim2后對同種移植物存活的影響
　　 將B6小鼠的背部全厚度皮片移植到SCID小鼠背部建立SCID小鼠移植模型，大約3周后移植皮片愈合生長完好。此時將預先經過放線菌酮或DMSO（對照）體外處理的野生型BALB/c小鼠脾T細胞通過腹腔注射過繼到上述已行移植術的SCID鼠體內。構建同種移植急性排斥反應模型，細胞過繼后每天觀察移植皮片的生存狀況。
　　 3、藥物體內處理對同種移植物存活的影響

29、r>　　 建立BALB/c小鼠同種移植模型，移植術后第1天開始每天腹腔注射放線菌酮、雷帕霉素或雷帕霉素+放線菌酮，直至對照組小鼠移植皮片發(fā)生排斥時結束藥物注射。每天觀察每組移植皮片的生存狀況并繪制同種移植皮片生存曲線。
　　 4、放線菌酮延長同種移植物存活的機制
　　 建立BALB/c小鼠同種移植模型，移植術后第1天開始每天腹腔注射放線菌酮、雷帕霉素或雷帕霉素+放線菌酮，直到對照組（腹腔注射生理鹽水）小鼠皮片完全被排斥

30、。此時制備脾細胞懸液并采用流式細胞術分析放線菌酮、雷帕霉素或雷帕霉素+放線菌酮體內給藥分別對同種反應性CD4+T細胞和CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例的影響。
　　 研究結果
　　 1、與對照組相比，放線菌酮明顯抑制pim2基因的表達，呈劑量依賴性，即50μM的放線菌酮能夠更有效地抑制pim2，且無明顯的細胞毒性。
　　 2、與對照組相比，放線菌酮處理組的移植皮片延長存活約7天(p＜0.05)，提示

31、放線菌酮可通過抑制T細胞中的pim2延長同種移植物的存活時間。
　　 3、結果顯示，對照組小鼠移植皮片的平均生存時間約為12.4±1.10天，注射放線菌酮組小鼠皮片的平均生存時間約為17.6±0.89天，注射雷帕霉素組小鼠皮片的平均生存時間約為19.6±1.52天，放線菌酮+雷帕霉素聯(lián)合組小鼠皮片的平均生存時間約為16.8±1.64天，比對照組分別延長約5天，7天和4天，具有顯著差異，P＜0.05。但是，聯(lián)合注射組與單獨注射放線

32、菌酮組之間無顯著差異，P＞0.05。提示放線菌酮體內應用明顯延長同種移植物的存活時間，但與雷帕霉素聯(lián)合沒有增強效應。
　　 4、與對照組比較，放線菌酮對CD4+T細胞擴增無明顯影響（分別為8.0％和8.7％），而雷帕霉素顯著降低CD4+T細胞比例(2.8％)，雷帕霉素+放線菌酮聯(lián)合亦可顯著降低CD4+T細胞比例(3.2％);與對照組(4.3％)比較，放線菌酮可降低CD4+CD25+Foxp3+T細胞比例(3.2％)，但是無統(tǒng)計學

33、差異，P＞0.05;雷帕霉素明顯誘導CD4+CD25+Foxp3+T細胞擴增(5.6％);雷帕霉素+放線菌酮聯(lián)合顯著上調CD4+CD25+Foxp3+T細胞比例(7.6％)，且聯(lián)合應用組CD4+CD25+Foxp3+T細胞的比例明顯高于雷帕霉素單獨注射組，P＜0.05。結果提示在同種移植模型中放線菌酮增強了雷帕霉素優(yōu)勢擴增CD4+CD25+Foxp3+T細胞的能力，而放線菌酮延長同種移植物存活除CD4+T細胞外，可能存在其它分子機制。<

34、br>　　 全文結論
　　 1.pim2在同種移植急性排斥高峰期高表達，Pim2蛋白的動態(tài)表達趨勢與同種移植急性排斥反應的發(fā)生過程一致，且在脾臟及移植物部位高表達。提示Pim2激酶參與同種移植急性排斥反應并介導移植物損害和組織損傷過程。
　　 2.Pim2通過磷酸化BAD Ser112位點對同種反應性T細胞發(fā)揮抗凋亡作用，并優(yōu)勢介導效應性CD4+CD25-T細胞的存活，從而發(fā)揮其增強同種移植排斥反應的作用;抑制pim2

35、可明顯延長同種移植物的存活時間。
　　 3.Pim2對同種抗原誘導的CD4+CD25+Foxp3+T細胞的增殖活化和發(fā)揮抑制功能是必要的;Pim2激酶對雷帕霉素選擇性擴增同種抗原誘導的CD4+CD25+Foxp3+T細胞也是必要的。
　　 4.放線菌酮通過抑制pim2可有效延長同種移植物存活，放線菌酮體內應用顯著增強雷帕霉素優(yōu)勢擴增CD4+CD25+Foxp3+T細胞的能力。
　　 本文創(chuàng)新點
　　 1.

36、首次利用小鼠同種皮膚移植模型，證實pim2在同種移植模型中高表達并且通過細胞凋亡信號通路增強同種移植急性排斥反應。研究結果為進一步闡明同種移植急性排斥反應的分子機制提供了理論依據。
　　 2.首次證實pim2蛋白對同種抗原誘導的CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞的增殖、抑制效應以及在雷帕霉素作用下的優(yōu)勢擴增是必要的;放線菌酮可增強雷帕霉素體內選擇性擴增CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞的能力。研究結果為CD4+C