125i-rFlic及125i-fFlic△180-400的制備及其在同種移植排斥監(jiān)測中的作用.pdf

1、目的：
　　器官移植在腫瘤、血液系統(tǒng)異常和器官功能衰竭等疾病治療中發(fā)揮了重要的作用，但是急性排斥反應(Acute Rejection，AR)仍是引發(fā)器官功能損害的重要因素，嚴重影響了移植者的預后。急性排斥反應一般發(fā)生于移植術后的數(shù)天或數(shù)月，應用無創(chuàng)非侵入性診斷技術進行早期動態(tài)監(jiān)測，對于延長移植器官壽命，治療疾病具有重要意義。盡管醫(yī)學多個學科對在體評價移植器官功能進行了多種探索，包括檢測循環(huán)中的移植排斥相關分子，組織活檢及常規(guī)影像學

2、檢查，但是迄今為止，移植器官的病理學組織活檢診斷仍是診斷急性移植排斥反應的金標準。由于組織活檢的創(chuàng)傷性和伴發(fā)的副作用嚴重制約了其在臨床上的應用。目前臨床上急需探索發(fā)現(xiàn)高選擇性移植器官組織的靶向分子，無創(chuàng)性非侵入性在體評價移植器官急性移植排斥反應及功能狀態(tài)。
　　分子影像學(molecular imaging)是近年來形成的將分子生物學技術與影像學技術相結合，進行分子水平上的定性定量的研究的科學。它以生物大分子作為靶點，可以實現(xiàn)在分

3、子水平上對人體內部的生理或病理過程中進行無創(chuàng)、實時的體外顯示及功能成像，實現(xiàn)疾病的早期診斷及預后。核分子影像中的放射性核素標記物可以有效進行體內示蹤，是分子影像學中發(fā)展最快最成熟的技術。目前臨床比較常用放射性核素氟18標記葡萄糖類似物進行正電子核素顯像評價移植腎功能.這項技術屬于非特異性分子影像，受到多種因素干擾;其他放射性核素標記分子的移植物顯像也尚在探索之中，因此探索高選擇性靶分子進行放射性核素標記，用于評價移植器官的功能狀態(tài)具有重

4、要意義。
　　近來研究表明，Toll樣受體家族(Toll-like receptor，TLRs)可特異性識別病原相關分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMPs)，在激活固有（非特異性）免疫和誘導調節(jié)適應性（特異性）免疫中發(fā)揮著重要的作用，是連接非特異性免疫和特異性免疫的重要紐帶。TLRs家族內唯一具有免疫負調節(jié)作用的分子是TLR5，它可以選擇性的高表達于調節(jié)性T細胞(Regul

5、atory T cells，Treg)的表面。研究發(fā)現(xiàn)，細菌鞭毛蛋白(Flagellin，F(xiàn)lic，TLR5的特異性激活劑)可以增強Treg細胞對效應性T細胞的抑制作用。鑒于TLR5能夠調控Treg細胞效應，而Treg細胞在同種異體皮膚移植中發(fā)揮重要的作用。Flic是TLR5的唯一外源性特異配體，可特異識別并結合TLR5，從而促進T細胞和體液免疫應答。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠急性移植排斥過程中，TLR5表達與移植排斥嚴重性呈正相關，

6、進一步提示TLR5可能是同種異體皮膚急性移植排斥中的關鍵分子。本論文制備放射性碘125標記基因重組Flagellin(rFlic)及其片段rFlic△180-400，研究其在同種移植急性排斥中的生物學分布及靶向性，旨在為靶向TLR5非侵入性實時監(jiān)測同種移植排斥提供實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1.小鼠皮膚移植模型的建立:
　　隨機選取C57BL/6小鼠（雌性，6-8周）作為供體，BALB/c小鼠（雌性，6-8周）作為受體

7、，構建小鼠同種異體皮膚移植模型;以BALB/c小鼠（雌性，6-8周）均作為供體和受體，構建同系皮膚移植模型。制備供體鼠全厚度移植皮片，置冷PBS中保存待用;受體小鼠腹腔注射0.6％的戊巴比妥鈉溶液(50μ g/g)進行麻醉，之后在其右側背部制備移植床，然后移植制備好的皮片。移植術后第7天進行拆包，每日仔細觀察并記錄移植皮片生長狀況。當移植物的壞死組織超過了90％時，即視為移植物完全排斥。
　　2.誘導表達基因重組鞭毛蛋白及其片段（

8、rFlic和rFlicΔ180-400）:
　　利用本實驗室保存的含有鞭毛蛋白全長(rFlic)及片段(rFlicΔ180-400)的GST-FliC-B.pseudomallei基因的pGEX4T-2質粒大腸桿菌BL21，分別通過IPTG誘導表達基因重組鞭毛蛋白及其片段（rFlic和rFlicΔ180-400），然后再用SDS-PAGE鑒定鞭毛蛋白誘導表達的狀況。最后再用抗GST標簽蛋白的抗體，通過蛋白印跡(Western Bl

9、ot)鑒定純化鞭毛蛋白及其片段所具有的生物活性。
　　3.125I-rFlic及rFlicΔ180-400的制備:
　　常規(guī)制備Iodogen涂管;通過Iodogen法，利用放射性核素碘-125碘化標記rFlic及rFlicΔ180-400，PD-10 Desalting凝膠柱（美國GE Healthcare）分離純化，收集洗脫液，留取蛋白峰。
　　4.標記物的放化純及穩(wěn)定性的測定:
　　檢測含有蛋白峰樣本的放射

10、性，計算其放射化學純度;體外放置不同時間檢測標記物的穩(wěn)定性。
　　5.放射性配基結合實驗:
　　脫椎處死BALB/c小鼠，取脾分離脾細胞加入試管，然后在試管中分別加入不同濃度的放射性核素碘-125標記rFlic及rFlicΔ180-400，在一定條件下，進行放射性標記配基的受體結合實驗。
　　6.藥代動力學實驗:
　　模型小鼠常規(guī)封閉甲狀腺后，在移植術后第8天分別通過尾靜脈注射125I-rFlic及125I-rF

11、licΔ180-400后，不同時間取血，測定放射性，進行藥代動力學分析。
　　7.體內生物學分布實驗:
　　模型小鼠常規(guī)封閉甲狀腺后，在移植術后第8天分別通過尾靜脈注射125I-rFlic及125I-rFlicΔ180-400，一定時間后，處死小鼠，取重要器官和移植皮片以及對側部位正常皮片，稱重、測量放射性。計算每克組織放射性占總放射性的百分比(％ID/g)。
　　8.全身磷屏放射自顯影顯像:
　　模型小鼠常規(guī)封

12、閉甲狀腺后，移植術后第8天分別向小鼠尾靜脈注射125I-rFlic及125I-rFlicΔ180-400，于注射后的6、24、48、72h，分別麻醉小鼠，進行全身磷屏放射自顯影顯像。
　　結果：
　　1.成功構建了小鼠同種/同系皮膚移植模型:皮膚移植后第7天移植部位拆包后，發(fā)現(xiàn)移植皮片柔軟、濕潤，觸摸皮下無硬結及顆粒感、周邊傷口愈合良好、無紅腫及膿液滲出，表明移植模型構建成功。
　　2.基因重組鞭毛蛋白及其片段（rFl

13、ic與rFlicΔ180-400）誘導表達后進行鑒定，結果證實:成功誘導表達了rFlic與rFlicΔ180-400，純化的rFlic與rFlicΔ180-400具有良好地生物學活性。
　　3.成功碘化標記了rFlic與rFlicΔ180-400:125I-rFlic標記率為（93.5±0.15）％，125I-rFlicΔ180-400的標記率為（94±0.25）％。二者皆保持了較高的穩(wěn)定性，72h后兩者的放射性化學純度仍高于93

14、％。
　　4.放射性配基結合實驗結果表明:125I-rFlic與125I-rFlicΔ180-400均可與BALB/c小鼠脾細胞的TLR5受體特異性結合，但125I-rFlicΔ180-400對BALB/c小鼠脾細胞TLR5的親和力更高(P＜0.05)。
　　5.藥代動力學結果表明:125I-rFlic與125I-rFlicΔ180-400在模型小鼠內均具有較好的藥物代謝動力學特性，符合二室分布模型。與125I-rFlic相

15、比，125I-rFlicΔ180-400可更快到達到分布平衡，并更快排出體外。
　　6.體內生物學分布結果顯示:兩種示蹤劑注射組，除移植皮片外，其它組織器官的放射性分布趨勢比較一致;主要聚集在肝、腎。24h時125I-rFlic注射組的T/NT（移植皮片/對側對照皮片）為2.5±0.34;而125I-rFlicΔ180-400注射組的T/NT比值明顯升高，為3.5±0.25;兩者具有顯著的差異(P＜0.05)。同系對照組移植皮片處

16、無明顯放射性濃集，24h時T/NT比值為1.45±0.54。與同系移植組相比，同種移植組的移植皮片處的放射性明顯升高。
　　7.磷屏放射自顯影顯像顯示:兩種標記物注射后6、24、48h，同系對照組移植皮片及其他各部位均未見明顯放射性濃集。而同種移植排斥組，注射后6h，與125I-rFlic組相比，125I-rFlicΔ180-400組移植皮片顯像清晰。24h時兩種標記物注射組皆可見到移植皮片的清晰圖像。48h時，圖像清晰度均下降。