125i-rFlic及125i-fFlic△180-400的制備及其在同種移植排斥監(jiān)測(cè)中的作用.pdf

1、目的：
　　器官移植在腫瘤、血液系統(tǒng)異常和器官功能衰竭等疾病治療中發(fā)揮了重要的作用，但是急性排斥反應(yīng)(Acute Rejection，AR)仍是引發(fā)器官功能損害的重要因素，嚴(yán)重影響了移植者的預(yù)后。急性排斥反應(yīng)一般發(fā)生于移植術(shù)后的數(shù)天或數(shù)月，應(yīng)用無創(chuàng)非侵入性診斷技術(shù)進(jìn)行早期動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，對(duì)于延長(zhǎng)移植器官壽命，治療疾病具有重要意義。盡管醫(yī)學(xué)多個(gè)學(xué)科對(duì)在體評(píng)價(jià)移植器官功能進(jìn)行了多種探索，包括檢測(cè)循環(huán)中的移植排斥相關(guān)分子，組織活檢及常規(guī)影像學(xué)

2、檢查，但是迄今為止，移植器官的病理學(xué)組織活檢診斷仍是診斷急性移植排斥反應(yīng)的金標(biāo)準(zhǔn)。由于組織活檢的創(chuàng)傷性和伴發(fā)的副作用嚴(yán)重制約了其在臨床上的應(yīng)用。目前臨床上急需探索發(fā)現(xiàn)高選擇性移植器官組織的靶向分子，無創(chuàng)性非侵入性在體評(píng)價(jià)移植器官急性移植排斥反應(yīng)及功能狀態(tài)。
　　分子影像學(xué)(molecular imaging)是近年來形成的將分子生物學(xué)技術(shù)與影像學(xué)技術(shù)相結(jié)合，進(jìn)行分子水平上的定性定量的研究的科學(xué)。它以生物大分子作為靶點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)在分

3、子水平上對(duì)人體內(nèi)部的生理或病理過程中進(jìn)行無創(chuàng)、實(shí)時(shí)的體外顯示及功能成像，實(shí)現(xiàn)疾病的早期診斷及預(yù)后。核分子影像中的放射性核素標(biāo)記物可以有效進(jìn)行體內(nèi)示蹤，是分子影像學(xué)中發(fā)展最快最成熟的技術(shù)。目前臨床比較常用放射性核素氟18標(biāo)記葡萄糖類似物進(jìn)行正電子核素顯像評(píng)價(jià)移植腎功能.這項(xiàng)技術(shù)屬于非特異性分子影像，受到多種因素干擾;其他放射性核素標(biāo)記分子的移植物顯像也尚在探索之中，因此探索高選擇性靶分子進(jìn)行放射性核素標(biāo)記，用于評(píng)價(jià)移植器官的功能狀態(tài)具有重

4、要意義。
　　近來研究表明，Toll樣受體家族(Toll-like receptor，TLRs)可特異性識(shí)別病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMPs)，在激活固有（非特異性）免疫和誘導(dǎo)調(diào)節(jié)適應(yīng)性（特異性）免疫中發(fā)揮著重要的作用，是連接非特異性免疫和特異性免疫的重要紐帶。TLRs家族內(nèi)唯一具有免疫負(fù)調(diào)節(jié)作用的分子是TLR5，它可以選擇性的高表達(dá)于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regul

5、atory T cells，Treg)的表面。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌鞭毛蛋白(Flagellin，F(xiàn)lic，TLR5的特異性激活劑)可以增強(qiáng)Treg細(xì)胞對(duì)效應(yīng)性T細(xì)胞的抑制作用。鑒于TLR5能夠調(diào)控Treg細(xì)胞效應(yīng)，而Treg細(xì)胞在同種異體皮膚移植中發(fā)揮重要的作用。Flic是TLR5的唯一外源性特異配體，可特異識(shí)別并結(jié)合TLR5，從而促進(jìn)T細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠急性移植排斥過程中，TLR5表達(dá)與移植排斥嚴(yán)重性呈正相關(guān)，

6、進(jìn)一步提示TLR5可能是同種異體皮膚急性移植排斥中的關(guān)鍵分子。本論文制備放射性碘125標(biāo)記基因重組Flagellin(rFlic)及其片段rFlic△180-400，研究其在同種移植急性排斥中的生物學(xué)分布及靶向性，旨在為靶向TLR5非侵入性實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)同種移植排斥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1.小鼠皮膚移植模型的建立:
　　隨機(jī)選取C57BL/6小鼠（雌性，6-8周）作為供體，BALB/c小鼠（雌性，6-8周）作為受體

7、，構(gòu)建小鼠同種異體皮膚移植模型;以BALB/c小鼠（雌性，6-8周）均作為供體和受體，構(gòu)建同系皮膚移植模型。制備供體鼠全厚度移植皮片，置冷PBS中保存待用;受體小鼠腹腔注射0.6％的戊巴比妥鈉溶液(50μ g/g)進(jìn)行麻醉，之后在其右側(cè)背部制備移植床，然后移植制備好的皮片。移植術(shù)后第7天進(jìn)行拆包，每日仔細(xì)觀察并記錄移植皮片生長(zhǎng)狀況。當(dāng)移植物的壞死組織超過了90％時(shí)，即視為移植物完全排斥。
　　2.誘導(dǎo)表達(dá)基因重組鞭毛蛋白及其片段（

8、rFlic和rFlicΔ180-400）:
　　利用本實(shí)驗(yàn)室保存的含有鞭毛蛋白全長(zhǎng)(rFlic)及片段(rFlicΔ180-400)的GST-FliC-B.pseudomallei基因的pGEX4T-2質(zhì)粒大腸桿菌BL21，分別通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)基因重組鞭毛蛋白及其片段（rFlic和rFlicΔ180-400），然后再用SDS-PAGE鑒定鞭毛蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的狀況。最后再用抗GST標(biāo)簽蛋白的抗體，通過蛋白印跡(Western Bl

9、ot)鑒定純化鞭毛蛋白及其片段所具有的生物活性。
　　3.125I-rFlic及rFlicΔ180-400的制備:
　　常規(guī)制備Iodogen涂管;通過Iodogen法，利用放射性核素碘-125碘化標(biāo)記rFlic及rFlicΔ180-400，PD-10 Desalting凝膠柱（美國(guó)GE Healthcare）分離純化，收集洗脫液，留取蛋白峰。
　　4.標(biāo)記物的放化純及穩(wěn)定性的測(cè)定:
　　檢測(cè)含有蛋白峰樣本的放射

10、性，計(jì)算其放射化學(xué)純度;體外放置不同時(shí)間檢測(cè)標(biāo)記物的穩(wěn)定性。
　　5.放射性配基結(jié)合實(shí)驗(yàn):
　　脫椎處死BALB/c小鼠，取脾分離脾細(xì)胞加入試管，然后在試管中分別加入不同濃度的放射性核素碘-125標(biāo)記rFlic及rFlicΔ180-400，在一定條件下，進(jìn)行放射性標(biāo)記配基的受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)。
　　6.藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn):
　　模型小鼠常規(guī)封閉甲狀腺后，在移植術(shù)后第8天分別通過尾靜脈注射125I-rFlic及125I-rF

11、licΔ180-400后，不同時(shí)間取血，測(cè)定放射性，進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)分析。
　　7.體內(nèi)生物學(xué)分布實(shí)驗(yàn):
　　模型小鼠常規(guī)封閉甲狀腺后，在移植術(shù)后第8天分別通過尾靜脈注射125I-rFlic及125I-rFlicΔ180-400，一定時(shí)間后，處死小鼠，取重要器官和移植皮片以及對(duì)側(cè)部位正常皮片，稱重、測(cè)量放射性。計(jì)算每克組織放射性占總放射性的百分比(％ID/g)。
　　8.全身磷屏放射自顯影顯像:
　　模型小鼠常規(guī)封

12、閉甲狀腺后，移植術(shù)后第8天分別向小鼠尾靜脈注射125I-rFlic及125I-rFlicΔ180-400，于注射后的6、24、48、72h，分別麻醉小鼠，進(jìn)行全身磷屏放射自顯影顯像。
　　結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建了小鼠同種/同系皮膚移植模型:皮膚移植后第7天移植部位拆包后，發(fā)現(xiàn)移植皮片柔軟、濕潤(rùn)，觸摸皮下無硬結(jié)及顆粒感、周邊傷口愈合良好、無紅腫及膿液滲出，表明移植模型構(gòu)建成功。
　　2.基因重組鞭毛蛋白及其片段（rFl

13、ic與rFlicΔ180-400）誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行鑒定，結(jié)果證實(shí):成功誘導(dǎo)表達(dá)了rFlic與rFlicΔ180-400，純化的rFlic與rFlicΔ180-400具有良好地生物學(xué)活性。
　　3.成功碘化標(biāo)記了rFlic與rFlicΔ180-400:125I-rFlic標(biāo)記率為（93.5±0.15）％，125I-rFlicΔ180-400的標(biāo)記率為（94±0.25）％。二者皆保持了較高的穩(wěn)定性，72h后兩者的放射性化學(xué)純度仍高于93

14、％。
　　4.放射性配基結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:125I-rFlic與125I-rFlicΔ180-400均可與BALB/c小鼠脾細(xì)胞的TLR5受體特異性結(jié)合，但125I-rFlicΔ180-400對(duì)BALB/c小鼠脾細(xì)胞TLR5的親和力更高(P＜0.05)。
　　5.藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果表明:125I-rFlic與125I-rFlicΔ180-400在模型小鼠內(nèi)均具有較好的藥物代謝動(dòng)力學(xué)特性，符合二室分布模型。與125I-rFlic相

15、比，125I-rFlicΔ180-400可更快到達(dá)到分布平衡，并更快排出體外。
　　6.體內(nèi)生物學(xué)分布結(jié)果顯示:兩種示蹤劑注射組，除移植皮片外，其它組織器官的放射性分布趨勢(shì)比較一致;主要聚集在肝、腎。24h時(shí)125I-rFlic注射組的T/NT（移植皮片/對(duì)側(cè)對(duì)照皮片）為2.5±0.34;而125I-rFlicΔ180-400注射組的T/NT比值明顯升高，為3.5±0.25;兩者具有顯著的差異(P＜0.05)。同系對(duì)照組移植皮片處

16、無明顯放射性濃集，24h時(shí)T/NT比值為1.45±0.54。與同系移植組相比，同種移植組的移植皮片處的放射性明顯升高。
　　7.磷屏放射自顯影顯像顯示:兩種標(biāo)記物注射后6、24、48h，同系對(duì)照組移植皮片及其他各部位均未見明顯放射性濃集。而同種移植排斥組，注射后6h，與125I-rFlic組相比，125I-rFlicΔ180-400組移植皮片顯像清晰。24h時(shí)兩種標(biāo)記物注射組皆可見到移植皮片的清晰圖像。48h時(shí)，圖像清晰度均下降。