固有免疫標志物MIF與TLR5在監(jiān)測同種移植排斥中的意義.pdf

1、研究目的:器官移植是目前治療各種臟器終末期功能衰竭的最有效手段。但是移植后的急性排斥反應(yīng)(AR)仍然是移植術(shù)后的主要并發(fā)癥，也是導(dǎo)致慢性排斥反應(yīng)(CR)和移植器官功能喪失的最重要的危險因素。如何快速診斷和及時治療急性排斥反應(yīng)一直是臨床器官移植研究的熱點。目前臨床上診斷急性排斥反應(yīng)的主要方法包括移植受者臨床表現(xiàn)、血液相關(guān)指標檢測、移植器官病理學(xué)活檢和影像學(xué)輔助檢查等，其中活檢組織病理學(xué)檢查仍然是診斷移植排斥反應(yīng)的最可靠手段，但其侵入性、潛

2、在并發(fā)癥及取樣誤差，限制了其臨床應(yīng)用。器官移植排斥反應(yīng)涉及范圍廣泛，免疫學(xué)機制復(fù)雜，迄今為止仍未發(fā)現(xiàn)公認的、無創(chuàng)傷性高敏感性和特異性的監(jiān)測指標。因此，尋找新的非創(chuàng)傷性侵入性監(jiān)測指標，早期、有效監(jiān)測移植排斥反應(yīng)，在移植器官功能發(fā)生損害之前及時做出診斷就成為移植免疫學(xué)領(lǐng)域亟待解決的問題。
　　 分子影像學(xué)(molecular imaging)是將分子生物學(xué)技術(shù)和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)影像學(xué)相結(jié)合而產(chǎn)生的一門新興的邊緣學(xué)科，是運用影像學(xué)手段顯示組織

3、水平、細胞和亞細胞水平的特定分子，反映活體狀態(tài)下分子水平變化，對其生物學(xué)行為在影像方面進行定性和定量研究的科學(xué)。經(jīng)典的影像診斷(CT、MRI等)主要顯示的是一些分子改變的終效應(yīng)，具有解剖學(xué)改變的疾病；而分子影像學(xué)通過發(fā)展新的工具、試劑及方法，探查疾病過程中細胞和分子水平的異常，在尚無解剖學(xué)改變前檢出異常，為探索疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸，評價藥物的療效，為分子水平疾病的治療奠定實驗和理論基礎(chǔ)。應(yīng)用分子影像學(xué)技術(shù)研究器官及組織移植術(shù)后的免疫學(xué)

4、細胞及分子水平的變化，有可能為臨床監(jiān)測移植排斥反應(yīng)提供重要手段。急性排斥反應(yīng)的分子影像學(xué)信息對于移植術(shù)后免疫抑制劑的個體化應(yīng)用、功效評價、危險因素監(jiān)測與評估，具有極其重要的指導(dǎo)意義。
　　 免疫應(yīng)答可以分為固有免疫和適應(yīng)性免疫兩大類。前者是指與生俱來的機體天然抵抗力。后者是指接觸抗原后機體產(chǎn)生的特異性免疫力。移植排斥反應(yīng)是一個復(fù)雜的免疫學(xué)過程，眾多免疫分子參與其中。固有免疫是機體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，隨著對移植免疫機理的深入研

5、究，人們逐漸意識到在移植排斥反應(yīng)過程中，固有免疫并不僅僅發(fā)揮非特異吞噬、清除作用，它與適應(yīng)性免疫一樣能夠正確區(qū)分“自己”和“非己”，并進一步調(diào)控適應(yīng)性免疫。在器官移植的不同階段，固有免疫與適應(yīng)性免疫系統(tǒng)之間都存在著復(fù)雜的密不可分的聯(lián)系。因此選擇在固有免疫和適應(yīng)性免疫中均發(fā)揮作用的標志分子，研究其在同種移植排斥過程中的表達狀態(tài)，探索其能否成為監(jiān)測移植排斥反應(yīng)的靶點分子，對于深入闡明移植排斥分子機理，指導(dǎo)臨床監(jiān)測排異反應(yīng)，更有效地防治移植排

6、斥具有重要的理論和實際意義。
　　 移植物進入機體后，移植物抗原致敏機體免疫細胞，被激活的免疫細胞進而產(chǎn)生多種細胞因子，引起免疫排斥反應(yīng)，由于細胞因子通常在排斥反應(yīng)早期即被釋放，因此可作為移植排斥反應(yīng)分子影像學(xué)的靶分子。已有研究者嘗試將放射性核素123I或111In標記的MHCⅡ類分子，99mTc標記的MCP-1(MonocyteChamotactic Protein)用于移植排斥反應(yīng)的分子影像學(xué)診斷，但由于所選顯像劑特異性不高

7、且在體內(nèi)清除緩慢，影響了其在臨床上的應(yīng)用。
　　 巨噬細胞移動抑制因子(MIF)是具有多種生物活性的可溶性淋巴因子，由活化的T細胞、巨噬細胞和其它多種細胞分泌，是免疫和內(nèi)分泌系統(tǒng)的重要介質(zhì)，具有激活巨噬細胞、抑制其游走、激活T細胞并增強其功能的作用，在急性炎癥和遲發(fā)型超敏反應(yīng)中有重要意義。近年來已有研究表明MIF是同種移植排斥過程中的重要介質(zhì)，MIF表達的上調(diào)與巨噬細胞、T細胞浸潤及同種腎移植排斥反應(yīng)的程度密切相關(guān)。此外，Tou

8、bai等研究發(fā)現(xiàn)在大鼠同種異體干細胞移植模型中MIF對移植物抗宿主病(GVHD)的發(fā)生、發(fā)展也起著關(guān)鍵的作用。鑒于MIF在同種移植排斥反應(yīng)中的重要作用，本研究第一部分選擇MIF作為同種移植排斥分子影像學(xué)的新靶點，闡明MIF的表達與移植排斥反應(yīng)程度的相關(guān)性，并在此基礎(chǔ)上利用放射性核素131I標記的MIF單克隆抗體作為分子顯像劑，動態(tài)監(jiān)測同種移植排斥反應(yīng)的全過程，旨在為無創(chuàng)傷性監(jiān)測移植排斥反應(yīng)探索新的途徑。
　　 準確評價移植術(shù)后免

9、疫抑制治療的效能，監(jiān)測受者的免疫狀態(tài)，根據(jù)受者的免疫狀態(tài)來調(diào)整免疫抑制劑的用量是移植監(jiān)測的另一關(guān)鍵目標。通過移植監(jiān)測可以指導(dǎo)移植后免疫抑制劑的合理使用，實現(xiàn)藥物應(yīng)用的個體化。由于免疫抑制劑可以抑制T細胞、B細胞等靶細胞的增殖及細胞因子合成，因此應(yīng)用免疫抑制劑之后如仍以移植排斥早期釋放的細胞因子作為分子影像學(xué)的成像對象顯然不能客觀地反應(yīng)移植物的免疫狀態(tài)。尋找移植排斥分子顯像新靶點，從而準確地評價移植后免疫抑制治療后的效能，是移植監(jiān)測領(lǐng)域的

10、又一關(guān)注熱點。
　　 Toll樣受體家族(TLRs)作為一種模式識別受體(PRR)可特異性識別病原相關(guān)分子模式(PAMPs)，不僅在激活固有免疫中發(fā)揮重要作用，而且還在誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫中具有重要意義，是連接固有免疫和適應(yīng)性免疫的重要橋梁。TLRs信號可以在自身抗原，同種抗原和異種抗原的刺激下激活。2008年研究發(fā)現(xiàn)小鼠心臟皮膚同種移植物的長期生存需要天然Tregs的存在，TLR9的特異激活劑CpG可以通過抑制Treg的功能和

11、促進Th1效應(yīng)性T細胞的分化，抑制同種移植物的存活。TLR7的激活可以促進皮膚同種移植物的排斥；TLR4的激活阻斷了利用抗CD154單抗建立的心臟同種移植物的長期存活，由此可見TLRs信號與移植排斥關(guān)系密切。
　　 TLR5是TLRs家族中唯一具有免疫負調(diào)節(jié)作用的分子，可直接間接地參與自身免疫病的發(fā)病過程。細菌鞭毛蛋白(Flagellin)是TLR5的唯一配體，F(xiàn)lagellin可特異識別結(jié)合TLR5，通過激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-κ

12、B刺激TNF-α、IL-1β、IL-8等前炎癥細胞因子的產(chǎn)生，介導(dǎo)機體天然免疫。最新研究表明，TLR5可選擇性高表達Treg細胞表面，TLR5的特異激活劑Flagellin可增強CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)對效應(yīng)性T細胞的抑制作用。2008年有研究報告體內(nèi)給予TLR5特異激活劑Flagellin，可以保護機體免受化學(xué)、細菌病毒和輻射等損害。鑒于Treg細胞在誘導(dǎo)同種移植物耐受過程具有重要作用，TLR5可以調(diào)控Treg細胞免

13、疫抑制效應(yīng)，提示TLR5可能是同種移植排斥過程中又一關(guān)鍵免疫分子。本課題第二部分在研究同種皮膚移植急性排斥過程中TLR5動態(tài)表達狀況和探討了免疫抑制劑雷帕霉素對TLR5表達的影響的基礎(chǔ)上，純化提取TLR5特異激活劑Flagellin，利用放射性核素131I標記Flagellin，并進行了初步鑒定，旨在闡明TLR5在移植排斥過程中的動態(tài)表達，初步探討其作為同種移植排斥標志分子的可行性。
　　 研究方法:
　　 1.MIF在

14、同種移植模型中的表達狀況：以BABL/c小鼠為受體，分別以B6小鼠、BABL/c小鼠為供體，建立小鼠同種、同系皮膚移植模型，于移植后第1、7、14、天，分別取移植部位的皮片，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測MIF mRNA的相對表達。同時利用免疫組織化學(xué)分析法測定移植后不同時間移植皮片內(nèi)MIF蛋白表達狀況。
　　 2.小鼠MIF單克隆抗體(anti-MIF McAb)的制備及生物學(xué)活性鑒定：采用雜交瘤技術(shù)制備小鼠MIF單克

15、隆抗體，蛋白質(zhì)印跡技術(shù)(Western blotting)及酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)鑒定其特異性，巨噬細胞移動抑制試驗(MM I)鑒定其生物學(xué)活性。
　　 3.131I-anti MIF McAb在小鼠同種皮膚移植模型中的分子顯像研究：建立小鼠同種及同系皮膚移植模型，Iodogen法制備131I-anti-MIF McAb、對照抗體131I-IgG。各實驗組分別于移植后第1、7、14天尾靜脈注射131I-anti-MIF

16、McAb或131I-IgG185 kBq/只，24小時后處死，收集血液、移植部位皮片、對側(cè)正常皮片及各組織、器官，觀察131I-anti-MIF McAb在小鼠同種皮膚移植模型中的生物學(xué)分布狀況，計算靶組織與非靶組織的放射性分布比值(T/NT)。同時于移植后各時間點尾靜脈注射131I-anti-MIF McAb或131I-IgG3.7 MBq，24小時后放射性自顯影下觀察131I-anti-MIF McAb及其對照抗體在移植皮片部位的放

17、射性濃聚狀況。
　　 4.TLR5在同種移植模型中的表達狀況：建立小鼠同種及同系皮膚移植模型，于移植后第1、7、14、21天，分別取同種移植及同系移植小鼠移植部位的皮片，RT-PCR法檢測TLR5 mRNA的相對表達量；免疫組織化學(xué)分析法測定移植皮片內(nèi)TLR5的蛋白表達狀況。
　　 5.免疫抑制劑雷帕霉素(Rapa)對移植受體TLR5表達及IL-10分泌的影響：建立小鼠同種皮膚移植模型，于移植后第1天腹腔注射Rapa1.

18、5mg/kg誘導(dǎo)移植耐受，觀察Rapa對TLR5 mRNA表達的影響。ELISA檢測Rapa對同種移植排斥高峰期活化T細胞IL-10分泌的影響。
　　 6.TLR5特異性激活劑Flagellin的制備：體外擴增培養(yǎng)甲型副傷寒桿菌，分離、純化Flagellin，鑒定Flagellin的純度及特異性。
　　 5.Flagellin體內(nèi)外處理對同種移植排斥的影響：建立小鼠同種皮膚移植模型，分別給予生理鹽水、Flagellin處

19、理后，觀察Flagellin對TLR5 mRNA的表達豐度、移植皮片生存狀況的影響及兩者間的相關(guān)性；同時收集同種皮膚移植術(shù)后第14天小鼠脾T細胞，經(jīng)體外分別給予不同濃度的Flagellin處理不同時間后，觀察各組TLR5mRNA的表達狀況。
　　 6.Iodogen法制備131I-Flagellin，鑒定其標記率、放射化學(xué)純度及體外穩(wěn)定性。
　　 結(jié)果:
　　 1.移植后第1天同種移植與同系移植組移植皮片MIF

20、mRNA的表達量與對側(cè)正常皮片無明顯差異。隨著移植排斥程度的加劇，同種移植組MIF的mRNA表達量在移植后第7天明顯增加，并于移植后第14天達到峰值，而同系移植組MIF的mRNA表達在移植后各時間點無明顯變化。免疫組織化學(xué)分析顯示在移植排斥過程中MIF蛋白的表達呈現(xiàn)與MIF mRNA表達一致的結(jié)果：即MIF的高表達僅出現(xiàn)在同種移植排斥模型中，且與移植排斥程度呈正相關(guān)。
　　 2.成功建立3株穩(wěn)定高效價分泌抗anti-MIF Mc

21、Ab的雜交瘤細胞株，分別命名為5G2D7，5G2C7，5G2E3。經(jīng)Western blotting、ELISA及MMI鑒定證明該抗anti-MIFMcAb具有良好的抗原特異性和生物學(xué)活性。
　　 3.生物學(xué)分布結(jié)果顯示：與對側(cè)正常皮片相比，131I-anti-MIF McAb在同種移植皮片部位可呈現(xiàn)較高的放射性，而同系移植皮片部位的放射性與對側(cè)正常皮片無明顯差異。131I-anti-MIF McAb在各組織器官的放射性分布結(jié)果

22、提示該顯像劑主要通過肝臟與腎臟代謝。在同種移植排斥早期131I-anti-MIF McAb的T/NT比值與對照顯像劑131I-mIgG相比無明顯差異，隨著移植排斥程度的加劇，131I-anti-MIFMcAb組的T/NT比值逐漸增加，在移植后第14天達到峰值17.13，而對照顯像劑的T/NT比值在整個移植排斥過程中呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。放射性自顯影結(jié)果驗證了上述結(jié)果：即同種移植后第1天131I-anti-MIF McAb與131I-IgG

23、均可在移植皮片部位呈現(xiàn)少量的放射性濃聚，隨著移植排斥反應(yīng)的加劇，131I-IgG在移植皮片部位的非特異性濃聚逐漸消退，而131I-anti-MIF McAb則呈現(xiàn)出較為清晰的影像。
　　 4.同種移植組TLR5的mRNA表達量在移植后逐漸增加，并于移植后第14天達到峰值，而同系移植組TLR5的mRNA表達在移植后各時間點無明顯變化。
　　 5.體內(nèi)給予Rapa處理后，移植皮片部位TLR5 mRNA的表達量在移植排斥高峰期

24、顯著增加。體外實驗結(jié)果顯示，同種移植排斥高峰期T細胞經(jīng)Rapa(100nmol/L)處理后，培養(yǎng)上清中的IL-10分泌逐漸增加，并于培養(yǎng)后72h達到峰值。
　　 6.從甲型副傷寒桿菌中成功分離、純化出Flagellin，Western Blotting證實所制備Flagellin具有高純度和高特異性。
　　 7.與生理鹽水處理組相比，同種皮膚移植模型小鼠經(jīng)體內(nèi)給予Flagellin處理后，TLR5 mRNA明顯高表達，且

25、可顯著延長移植皮片生存時間(21.57±1.4d)，TLR5 mRNA表達量與移植皮片生存時間的變化呈明顯正相關(guān)趨勢；經(jīng)不同濃度Flagellin體外處理急性排斥期小鼠T細胞不同時間后發(fā)現(xiàn)，TLR5mRNA在Flagellin濃度100ng/ml，培養(yǎng)6h組表達量最高。
　　 8.成功制備131I-Flagellin，其標記率為91.6％，比活度為35.27 GBq/μmol；室溫放置72小時后仍具有較好的穩(wěn)定性與免疫學(xué)活性。<

26、br>　　 結(jié)論:
　　 1.在同種皮膚移植模型中，MIF的表達量與移植排斥程度密切正相關(guān)。
　　 2.成功制備了抗小鼠MIF單克隆抗體。
　　 3.131I-anti-MIF McAb在同種移植皮片部位可呈現(xiàn)特異性濃聚，作為分子顯像劑可較為清晰地顯示移植排斥全過程。
　　 4.在同種皮膚移植模型中，TLR5的表達量與移植排斥程度密切相關(guān)。免疫抑制劑Rapa可上調(diào)移植皮片部位TLR5 mRNA的表達，促

27、進同種移植排斥高峰期活化T細胞IL-10的分泌。
　　 5.成功制各TLR5特異性激活劑Flagellin。體內(nèi)外實驗證實Flagellin可顯著增加移植部位TLR5 mRNA的表達，并延長同種移植皮片的生存時間。
　　 6.成功制備了131I-Flagellin，131I-Flagellin具有較好的體外穩(wěn)定性。
　　 創(chuàng)新點:
　　 1.本研究以MIF作為同種移植排斥監(jiān)測的新靶點，首次以131I-an

28、ti-MIF McAb作為同種移植排斥的分子顯像劑，證實了該顯像劑在同種移植排斥監(jiān)測中的高敏感與高特異性。
　　 2.首次利用磷屏放射性自顯影技術(shù)，證實利用131I-anti-MIF McAb作為分子顯像劑，可以直觀、清晰地動態(tài)監(jiān)測同種移植排斥全部進程。
　　 3.首次研究了TLR5與移植排斥進程的相關(guān)性及免疫抑制劑Rapa對TLR5表達的上調(diào)作用；首次制備了放射性碘131標記的TLR5特異性配體Flagellin；初步