固有免疫標(biāo)志物MIF與TLR5在監(jiān)測同種移植排斥中的意義.pdf

1、研究目的:器官移植是目前治療各種臟器終末期功能衰竭的最有效手段。但是移植后的急性排斥反應(yīng)(AR)仍然是移植術(shù)后的主要并發(fā)癥，也是導(dǎo)致慢性排斥反應(yīng)(CR)和移植器官功能喪失的最重要的危險(xiǎn)因素。如何快速診斷和及時(shí)治療急性排斥反應(yīng)一直是臨床器官移植研究的熱點(diǎn)。目前臨床上診斷急性排斥反應(yīng)的主要方法包括移植受者臨床表現(xiàn)、血液相關(guān)指標(biāo)檢測、移植器官病理學(xué)活檢和影像學(xué)輔助檢查等，其中活檢組織病理學(xué)檢查仍然是診斷移植排斥反應(yīng)的最可靠手段，但其侵入性、潛

2、在并發(fā)癥及取樣誤差，限制了其臨床應(yīng)用。器官移植排斥反應(yīng)涉及范圍廣泛，免疫學(xué)機(jī)制復(fù)雜，迄今為止仍未發(fā)現(xiàn)公認(rèn)的、無創(chuàng)傷性高敏感性和特異性的監(jiān)測指標(biāo)。因此，尋找新的非創(chuàng)傷性侵入性監(jiān)測指標(biāo)，早期、有效監(jiān)測移植排斥反應(yīng)，在移植器官功能發(fā)生損害之前及時(shí)做出診斷就成為移植免疫學(xué)領(lǐng)域亟待解決的問題。
　　 分子影像學(xué)(molecular imaging)是將分子生物學(xué)技術(shù)和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)影像學(xué)相結(jié)合而產(chǎn)生的一門新興的邊緣學(xué)科，是運(yùn)用影像學(xué)手段顯示組織

3、水平、細(xì)胞和亞細(xì)胞水平的特定分子，反映活體狀態(tài)下分子水平變化，對(duì)其生物學(xué)行為在影像方面進(jìn)行定性和定量研究的科學(xué)。經(jīng)典的影像診斷(CT、MRI等)主要顯示的是一些分子改變的終效應(yīng)，具有解剖學(xué)改變的疾??；而分子影像學(xué)通過發(fā)展新的工具、試劑及方法，探查疾病過程中細(xì)胞和分子水平的異常，在尚無解剖學(xué)改變前檢出異常，為探索疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸，評(píng)價(jià)藥物的療效，為分子水平疾病的治療奠定實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。應(yīng)用分子影像學(xué)技術(shù)研究器官及組織移植術(shù)后的免疫學(xué)

4、細(xì)胞及分子水平的變化，有可能為臨床監(jiān)測移植排斥反應(yīng)提供重要手段。急性排斥反應(yīng)的分子影像學(xué)信息對(duì)于移植術(shù)后免疫抑制劑的個(gè)體化應(yīng)用、功效評(píng)價(jià)、危險(xiǎn)因素監(jiān)測與評(píng)估，具有極其重要的指導(dǎo)意義。
　　 免疫應(yīng)答可以分為固有免疫和適應(yīng)性免疫兩大類。前者是指與生俱來的機(jī)體天然抵抗力。后者是指接觸抗原后機(jī)體產(chǎn)生的特異性免疫力。移植排斥反應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的免疫學(xué)過程，眾多免疫分子參與其中。固有免疫是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，隨著對(duì)移植免疫機(jī)理的深入研

5、究，人們逐漸意識(shí)到在移植排斥反應(yīng)過程中，固有免疫并不僅僅發(fā)揮非特異吞噬、清除作用，它與適應(yīng)性免疫一樣能夠正確區(qū)分“自己”和“非己”，并進(jìn)一步調(diào)控適應(yīng)性免疫。在器官移植的不同階段，固有免疫與適應(yīng)性免疫系統(tǒng)之間都存在著復(fù)雜的密不可分的聯(lián)系。因此選擇在固有免疫和適應(yīng)性免疫中均發(fā)揮作用的標(biāo)志分子，研究其在同種移植排斥過程中的表達(dá)狀態(tài)，探索其能否成為監(jiān)測移植排斥反應(yīng)的靶點(diǎn)分子，對(duì)于深入闡明移植排斥分子機(jī)理，指導(dǎo)臨床監(jiān)測排異反應(yīng)，更有效地防治移植排

6、斥具有重要的理論和實(shí)際意義。
　　 移植物進(jìn)入機(jī)體后，移植物抗原致敏機(jī)體免疫細(xì)胞，被激活的免疫細(xì)胞進(jìn)而產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，引起免疫排斥反應(yīng)，由于細(xì)胞因子通常在排斥反應(yīng)早期即被釋放，因此可作為移植排斥反應(yīng)分子影像學(xué)的靶分子。已有研究者嘗試將放射性核素123I或111In標(biāo)記的MHCⅡ類分子，99mTc標(biāo)記的MCP-1(MonocyteChamotactic Protein)用于移植排斥反應(yīng)的分子影像學(xué)診斷，但由于所選顯像劑特異性不高

7、且在體內(nèi)清除緩慢，影響了其在臨床上的應(yīng)用。
　　 巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)是具有多種生物活性的可溶性淋巴因子，由活化的T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和其它多種細(xì)胞分泌，是免疫和內(nèi)分泌系統(tǒng)的重要介質(zhì)，具有激活巨噬細(xì)胞、抑制其游走、激活T細(xì)胞并增強(qiáng)其功能的作用，在急性炎癥和遲發(fā)型超敏反應(yīng)中有重要意義。近年來已有研究表明MIF是同種移植排斥過程中的重要介質(zhì)，MIF表達(dá)的上調(diào)與巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞浸潤及同種腎移植排斥反應(yīng)的程度密切相關(guān)。此外，Tou

8、bai等研究發(fā)現(xiàn)在大鼠同種異體干細(xì)胞移植模型中MIF對(duì)移植物抗宿主病(GVHD)的發(fā)生、發(fā)展也起著關(guān)鍵的作用。鑒于MIF在同種移植排斥反應(yīng)中的重要作用，本研究第一部分選擇MIF作為同種移植排斥分子影像學(xué)的新靶點(diǎn)，闡明MIF的表達(dá)與移植排斥反應(yīng)程度的相關(guān)性，并在此基礎(chǔ)上利用放射性核素131I標(biāo)記的MIF單克隆抗體作為分子顯像劑，動(dòng)態(tài)監(jiān)測同種移植排斥反應(yīng)的全過程，旨在為無創(chuàng)傷性監(jiān)測移植排斥反應(yīng)探索新的途徑。
　　 準(zhǔn)確評(píng)價(jià)移植術(shù)后免

9、疫抑制治療的效能，監(jiān)測受者的免疫狀態(tài)，根據(jù)受者的免疫狀態(tài)來調(diào)整免疫抑制劑的用量是移植監(jiān)測的另一關(guān)鍵目標(biāo)。通過移植監(jiān)測可以指導(dǎo)移植后免疫抑制劑的合理使用，實(shí)現(xiàn)藥物應(yīng)用的個(gè)體化。由于免疫抑制劑可以抑制T細(xì)胞、B細(xì)胞等靶細(xì)胞的增殖及細(xì)胞因子合成，因此應(yīng)用免疫抑制劑之后如仍以移植排斥早期釋放的細(xì)胞因子作為分子影像學(xué)的成像對(duì)象顯然不能客觀地反應(yīng)移植物的免疫狀態(tài)。尋找移植排斥分子顯像新靶點(diǎn)，從而準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)移植后免疫抑制治療后的效能，是移植監(jiān)測領(lǐng)域的

10、又一關(guān)注熱點(diǎn)。
　　 Toll樣受體家族(TLRs)作為一種模式識(shí)別受體(PRR)可特異性識(shí)別病原相關(guān)分子模式(PAMPs)，不僅在激活固有免疫中發(fā)揮重要作用，而且還在誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫中具有重要意義，是連接固有免疫和適應(yīng)性免疫的重要橋梁。TLRs信號(hào)可以在自身抗原，同種抗原和異種抗原的刺激下激活。2008年研究發(fā)現(xiàn)小鼠心臟皮膚同種移植物的長期生存需要天然Tregs的存在，TLR9的特異激活劑CpG可以通過抑制Treg的功能和

11、促進(jìn)Th1效應(yīng)性T細(xì)胞的分化，抑制同種移植物的存活。TLR7的激活可以促進(jìn)皮膚同種移植物的排斥；TLR4的激活阻斷了利用抗CD154單抗建立的心臟同種移植物的長期存活，由此可見TLRs信號(hào)與移植排斥關(guān)系密切。
　　 TLR5是TLRs家族中唯一具有免疫負(fù)調(diào)節(jié)作用的分子，可直接間接地參與自身免疫病的發(fā)病過程。細(xì)菌鞭毛蛋白(Flagellin)是TLR5的唯一配體，F(xiàn)lagellin可特異識(shí)別結(jié)合TLR5，通過激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-κ

12、B刺激TNF-α、IL-1β、IL-8等前炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，介導(dǎo)機(jī)體天然免疫。最新研究表明，TLR5可選擇性高表達(dá)Treg細(xì)胞表面，TLR5的特異激活劑Flagellin可增強(qiáng)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)對(duì)效應(yīng)性T細(xì)胞的抑制作用。2008年有研究報(bào)告體內(nèi)給予TLR5特異激活劑Flagellin，可以保護(hù)機(jī)體免受化學(xué)、細(xì)菌病毒和輻射等損害。鑒于Treg細(xì)胞在誘導(dǎo)同種移植物耐受過程具有重要作用，TLR5可以調(diào)控Treg細(xì)胞免

13、疫抑制效應(yīng)，提示TLR5可能是同種移植排斥過程中又一關(guān)鍵免疫分子。本課題第二部分在研究同種皮膚移植急性排斥過程中TLR5動(dòng)態(tài)表達(dá)狀況和探討了免疫抑制劑雷帕霉素對(duì)TLR5表達(dá)的影響的基礎(chǔ)上，純化提取TLR5特異激活劑Flagellin，利用放射性核素131I標(biāo)記Flagellin，并進(jìn)行了初步鑒定，旨在闡明TLR5在移植排斥過程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)，初步探討其作為同種移植排斥標(biāo)志分子的可行性。
　　 研究方法:
　　 1.MIF在

14、同種移植模型中的表達(dá)狀況：以BABL/c小鼠為受體，分別以B6小鼠、BABL/c小鼠為供體，建立小鼠同種、同系皮膚移植模型，于移植后第1、7、14、天，分別取移植部位的皮片，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測MIF mRNA的相對(duì)表達(dá)。同時(shí)利用免疫組織化學(xué)分析法測定移植后不同時(shí)間移植皮片內(nèi)MIF蛋白表達(dá)狀況。
　　 2.小鼠MIF單克隆抗體(anti-MIF McAb)的制備及生物學(xué)活性鑒定：采用雜交瘤技術(shù)制備小鼠MIF單克

15、隆抗體，蛋白質(zhì)印跡技術(shù)(Western blotting)及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)鑒定其特異性，巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制試驗(yàn)(MM I)鑒定其生物學(xué)活性。
　　 3.131I-anti MIF McAb在小鼠同種皮膚移植模型中的分子顯像研究：建立小鼠同種及同系皮膚移植模型，Iodogen法制備131I-anti-MIF McAb、對(duì)照抗體131I-IgG。各實(shí)驗(yàn)組分別于移植后第1、7、14天尾靜脈注射131I-anti-MIF

16、McAb或131I-IgG185 kBq/只，24小時(shí)后處死，收集血液、移植部位皮片、對(duì)側(cè)正常皮片及各組織、器官，觀察131I-anti-MIF McAb在小鼠同種皮膚移植模型中的生物學(xué)分布狀況，計(jì)算靶組織與非靶組織的放射性分布比值(T/NT)。同時(shí)于移植后各時(shí)間點(diǎn)尾靜脈注射131I-anti-MIF McAb或131I-IgG3.7 MBq，24小時(shí)后放射性自顯影下觀察131I-anti-MIF McAb及其對(duì)照抗體在移植皮片部位的放

17、射性濃聚狀況。
　　 4.TLR5在同種移植模型中的表達(dá)狀況：建立小鼠同種及同系皮膚移植模型，于移植后第1、7、14、21天，分別取同種移植及同系移植小鼠移植部位的皮片，RT-PCR法檢測TLR5 mRNA的相對(duì)表達(dá)量；免疫組織化學(xué)分析法測定移植皮片內(nèi)TLR5的蛋白表達(dá)狀況。
　　 5.免疫抑制劑雷帕霉素(Rapa)對(duì)移植受體TLR5表達(dá)及IL-10分泌的影響：建立小鼠同種皮膚移植模型，于移植后第1天腹腔注射Rapa1.

18、5mg/kg誘導(dǎo)移植耐受，觀察Rapa對(duì)TLR5 mRNA表達(dá)的影響。ELISA檢測Rapa對(duì)同種移植排斥高峰期活化T細(xì)胞IL-10分泌的影響。
　　 6.TLR5特異性激活劑Flagellin的制備：體外擴(kuò)增培養(yǎng)甲型副傷寒桿菌，分離、純化Flagellin，鑒定Flagellin的純度及特異性。
　　 5.Flagellin體內(nèi)外處理對(duì)同種移植排斥的影響：建立小鼠同種皮膚移植模型，分別給予生理鹽水、Flagellin處

19、理后，觀察Flagellin對(duì)TLR5 mRNA的表達(dá)豐度、移植皮片生存狀況的影響及兩者間的相關(guān)性；同時(shí)收集同種皮膚移植術(shù)后第14天小鼠脾T細(xì)胞，經(jīng)體外分別給予不同濃度的Flagellin處理不同時(shí)間后，觀察各組TLR5mRNA的表達(dá)狀況。
　　 6.Iodogen法制備131I-Flagellin，鑒定其標(biāo)記率、放射化學(xué)純度及體外穩(wěn)定性。
　　 結(jié)果:
　　 1.移植后第1天同種移植與同系移植組移植皮片MIF

20、mRNA的表達(dá)量與對(duì)側(cè)正常皮片無明顯差異。隨著移植排斥程度的加劇，同種移植組MIF的mRNA表達(dá)量在移植后第7天明顯增加，并于移植后第14天達(dá)到峰值，而同系移植組MIF的mRNA表達(dá)在移植后各時(shí)間點(diǎn)無明顯變化。免疫組織化學(xué)分析顯示在移植排斥過程中MIF蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)與MIF mRNA表達(dá)一致的結(jié)果：即MIF的高表達(dá)僅出現(xiàn)在同種移植排斥模型中，且與移植排斥程度呈正相關(guān)。
　　 2.成功建立3株穩(wěn)定高效價(jià)分泌抗anti-MIF Mc

21、Ab的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為5G2D7，5G2C7，5G2E3。經(jīng)Western blotting、ELISA及MMI鑒定證明該抗anti-MIFMcAb具有良好的抗原特異性和生物學(xué)活性。
　　 3.生物學(xué)分布結(jié)果顯示：與對(duì)側(cè)正常皮片相比，131I-anti-MIF McAb在同種移植皮片部位可呈現(xiàn)較高的放射性，而同系移植皮片部位的放射性與對(duì)側(cè)正常皮片無明顯差異。131I-anti-MIF McAb在各組織器官的放射性分布結(jié)果

22、提示該顯像劑主要通過肝臟與腎臟代謝。在同種移植排斥早期131I-anti-MIF McAb的T/NT比值與對(duì)照顯像劑131I-mIgG相比無明顯差異，隨著移植排斥程度的加劇，131I-anti-MIFMcAb組的T/NT比值逐漸增加，在移植后第14天達(dá)到峰值17.13，而對(duì)照顯像劑的T/NT比值在整個(gè)移植排斥過程中呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。放射性自顯影結(jié)果驗(yàn)證了上述結(jié)果：即同種移植后第1天131I-anti-MIF McAb與131I-IgG

23、均可在移植皮片部位呈現(xiàn)少量的放射性濃聚，隨著移植排斥反應(yīng)的加劇，131I-IgG在移植皮片部位的非特異性濃聚逐漸消退，而131I-anti-MIF McAb則呈現(xiàn)出較為清晰的影像。
　　 4.同種移植組TLR5的mRNA表達(dá)量在移植后逐漸增加，并于移植后第14天達(dá)到峰值，而同系移植組TLR5的mRNA表達(dá)在移植后各時(shí)間點(diǎn)無明顯變化。
　　 5.體內(nèi)給予Rapa處理后，移植皮片部位TLR5 mRNA的表達(dá)量在移植排斥高峰期

24、顯著增加。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，同種移植排斥高峰期T細(xì)胞經(jīng)Rapa(100nmol/L)處理后，培養(yǎng)上清中的IL-10分泌逐漸增加，并于培養(yǎng)后72h達(dá)到峰值。
　　 6.從甲型副傷寒桿菌中成功分離、純化出Flagellin，Western Blotting證實(shí)所制備Flagellin具有高純度和高特異性。
　　 7.與生理鹽水處理組相比，同種皮膚移植模型小鼠經(jīng)體內(nèi)給予Flagellin處理后，TLR5 mRNA明顯高表達(dá)，且

25、可顯著延長移植皮片生存時(shí)間(21.57±1.4d)，TLR5 mRNA表達(dá)量與移植皮片生存時(shí)間的變化呈明顯正相關(guān)趨勢；經(jīng)不同濃度Flagellin體外處理急性排斥期小鼠T細(xì)胞不同時(shí)間后發(fā)現(xiàn)，TLR5mRNA在Flagellin濃度100ng/ml，培養(yǎng)6h組表達(dá)量最高。
　　 8.成功制備131I-Flagellin，其標(biāo)記率為91.6％，比活度為35.27 GBq/μmol；室溫放置72小時(shí)后仍具有較好的穩(wěn)定性與免疫學(xué)活性。<

26、br>　　 結(jié)論:
　　 1.在同種皮膚移植模型中，MIF的表達(dá)量與移植排斥程度密切正相關(guān)。
　　 2.成功制備了抗小鼠MIF單克隆抗體。
　　 3.131I-anti-MIF McAb在同種移植皮片部位可呈現(xiàn)特異性濃聚，作為分子顯像劑可較為清晰地顯示移植排斥全過程。
　　 4.在同種皮膚移植模型中，TLR5的表達(dá)量與移植排斥程度密切相關(guān)。免疫抑制劑Rapa可上調(diào)移植皮片部位TLR5 mRNA的表達(dá)，促

27、進(jìn)同種移植排斥高峰期活化T細(xì)胞IL-10的分泌。
　　 5.成功制各TLR5特異性激活劑Flagellin。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)Flagellin可顯著增加移植部位TLR5 mRNA的表達(dá)，并延長同種移植皮片的生存時(shí)間。
　　 6.成功制備了131I-Flagellin，131I-Flagellin具有較好的體外穩(wěn)定性。
　　 創(chuàng)新點(diǎn):
　　 1.本研究以MIF作為同種移植排斥監(jiān)測的新靶點(diǎn)，首次以131I-an

28、ti-MIF McAb作為同種移植排斥的分子顯像劑，證實(shí)了該顯像劑在同種移植排斥監(jiān)測中的高敏感與高特異性。
　　 2.首次利用磷屏放射性自顯影技術(shù)，證實(shí)利用131I-anti-MIF McAb作為分子顯像劑，可以直觀、清晰地動(dòng)態(tài)監(jiān)測同種移植排斥全部進(jìn)程。
　　 3.首次研究了TLR5與移植排斥進(jìn)程的相關(guān)性及免疫抑制劑Rapa對(duì)TLR5表達(dá)的上調(diào)作用；首次制備了放射性碘131標(biāo)記的TLR5特異性配體Flagellin；初步