地磷莫司抑制同種異體器官移植免疫排斥作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:器官移植是解決終末器官衰竭的最佳途徑之一，心臟移植與胰島移植已分別應(yīng)用于各自臨床領(lǐng)域，并起到不錯(cuò)的效果。但是臨床應(yīng)用中遇到最大的問(wèn)題就是免疫排斥問(wèn)題，自身的免疫排斥導(dǎo)致移植器官過(guò)早的衰竭而失去功能，出現(xiàn)一系列生理問(wèn)題，無(wú)法正常生活，嚴(yán)重影響到移植后患者的生命和器官移植在臨床的應(yīng)用。為了抑制免疫，保護(hù)移植器官，延長(zhǎng)移植物生存期，延長(zhǎng)終末期疾病患者的生命，臨床上已應(yīng)用多種免疫抑制劑，但是因?yàn)槠鋬r(jià)格昂貴，毒副作用強(qiáng)等原因阻礙了其在臨床的

2、應(yīng)用，因此開發(fā)新型的毒副作用小的免疫抑制劑具有重要的意義。作為首例絲氨酸/蘇氨酸激酶mTOR結(jié)合藥物，雷帕霉素在臨床的應(yīng)用己得到公認(rèn)，其結(jié)合mTOR可以控制細(xì)胞代謝、增殖、分化，同時(shí)也是抗癌的一個(gè)重要機(jī)制。但是由于雷帕霉素的水溶性較弱、半衰期長(zhǎng)、化學(xué)穩(wěn)定性較弱，其在器官移植領(lǐng)域的應(yīng)用中受到了限制，使其無(wú)法達(dá)到器官移植免疫抑制的有效濃度。雷帕霉素的C40是一個(gè)理想的藥物化學(xué)改變位點(diǎn)，C40遠(yuǎn)離FKBP12和mTOR的主要結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)其進(jìn)行

3、二甲基磷酰化，得到具有高溶解性、高穩(wěn)定性、高生物利用度等優(yōu)點(diǎn)的地磷莫司。地磷莫司的諸多優(yōu)點(diǎn)使其得到FDA快速批準(zhǔn)應(yīng)用于軟組織與骨肉瘤的治療，其關(guān)于治療血液癌（淋巴瘤和白血?。┑亩谂R床試驗(yàn)已經(jīng)完成，子宮內(nèi)膜癌的二期臨床試驗(yàn)也已展開。而其關(guān)于免疫抑制作用的研究未見(jiàn)報(bào)道。為了開發(fā)其在器官移植領(lǐng)域的應(yīng)用，我們擬借助胰島移植、心臟移植模型以及體外實(shí)驗(yàn)，研究其免疫抑制機(jī)制，為地磷莫司進(jìn)一步進(jìn)行臨床試驗(yàn)打下基礎(chǔ)，為其能順利應(yīng)用于臨床器官移植做好鋪墊

4、。
　　方法:我們首先在體外實(shí)驗(yàn)中研究地磷莫司的免疫抑制作用及其作用機(jī)制。采用混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)等確定其具有免疫抑制作用，再用凋亡實(shí)驗(yàn)、克隆無(wú)能實(shí)驗(yàn)、CFSE、ELISA等探討地磷莫司的免疫抑制作用機(jī)制及其影響細(xì)胞分泌的炎性因子情況;其次，我們建立了小鼠胰島移植模型和小鼠心臟移植模型，研究地磷莫司保護(hù)移植物、延長(zhǎng)移植物生存期的作用;最后，我們通過(guò)對(duì)受體鼠體內(nèi)移植物病理切片、供者特異性抗原引起的免疫應(yīng)答能力、T細(xì)胞亞

5、群、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞等進(jìn)行分析，試圖闡明地磷莫司抑制同種異體器官移植免疫排斥反應(yīng)，延長(zhǎng)移植物生存期的機(jī)制，以此來(lái)分析其作為免疫抑制劑應(yīng)用于器官移植的可行性。
　　結(jié)果:在體外實(shí)驗(yàn)中，我們首先運(yùn)用淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)確定了地磷莫司可以抑制淋巴細(xì)胞/T細(xì)胞的增殖，我們用供體特異性抗原（Balb/c細(xì)胞）刺激受體細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了地磷莫司在體外可以抑制供體特異性抗原刺激的細(xì)胞增殖，且地磷莫司濃度為1ng/mL的時(shí)候已達(dá)到最佳的抑制增殖效果;我們

6、運(yùn)用CFSE標(biāo)記的方法驗(yàn)證了地磷莫司可以同時(shí)抑制CD4+/CD8+T細(xì)胞的供體特異性抗原刺激的增殖，且對(duì)CD4+T細(xì)胞的抑制效果更顯著;我們用流式檢測(cè)了地磷莫司對(duì)淋巴細(xì)胞/T細(xì)胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)地磷莫司不會(huì)引起淋巴細(xì)胞/T細(xì)胞的凋亡;我們做了克隆無(wú)能實(shí)驗(yàn)，外源IL-2(100U/mL)可以恢復(fù)地磷莫司抑制的T細(xì)胞的增殖能力，說(shuō)明克隆無(wú)能是地磷莫司誘導(dǎo)免疫耐受的機(jī)制之一;通過(guò)對(duì)T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，地磷莫司抑制了Th1型細(xì)胞因子

7、（IL-2/IFN-γ）的分泌，同時(shí)促進(jìn)了Th2型細(xì)胞因子（IL-4）的分泌和TGF-β的分泌;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，地磷莫司可以延長(zhǎng)小鼠同種異體胰島移植模型/小鼠同種異體心臟移植模型中移植物生存期;由HE切片/生存期我們得出，地磷莫司可以抑制炎癥因子浸潤(rùn)、保護(hù)移植物，從而延長(zhǎng)生存期;由混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)我們得到，地磷莫司可以抑制經(jīng)過(guò)胰島移植/心臟移植后的淋巴細(xì)胞/T細(xì)胞供體特異性免疫應(yīng)答活性，我們通過(guò)CFSE染色的方法得到地磷莫司可以同時(shí)抑制

8、CD4+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞供體特異性抗原刺激的增殖活性;我們對(duì)移植術(shù)后的受體小鼠的脾臟T細(xì)胞亞群細(xì)胞比例的檢測(cè)得出，地磷莫司抑制了受體小鼠脾臟中CD4+T細(xì)胞比例，抑制了受體小鼠脾臟中CD8+T細(xì)胞比例，升高了受體小鼠體內(nèi)CD19+B細(xì)胞比例;對(duì)受體小鼠脾臟/淋巴結(jié)中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例的分析得到，地磷莫司可以同時(shí)提高小鼠脾臟/淋巴結(jié)中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例;對(duì)于受體小鼠血清中細(xì)胞因子IL-2/IL-4/IFN-γ/TGF-β的ELISA檢測(cè)

9、可以得出，地磷莫司抑制了受體小鼠血清中細(xì)胞因子IL-2/IFN-γ的分泌，提高了受體小鼠血清中細(xì)胞因子IL-4/TGF-β的分泌。
　　結(jié)論:通過(guò)本課題的研究，我們首次證實(shí)了地磷莫司具有免疫抑制作用，可通過(guò)抑制增殖，誘導(dǎo)克隆無(wú)能，抑制T亞群細(xì)胞比例，誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，抑制Th1型細(xì)胞分子的分泌，促進(jìn)Th2型細(xì)胞分子的分泌等機(jī)制減少移植物炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，保護(hù)移植物，延長(zhǎng)同種異體胰島移植/心臟移植移植物生存期。本課題的研究為地磷莫司應(yīng)用