深低溫冷凍時間對同種異體氣管移植免疫抑制作用的實驗研究.pdf

1、臨床上多種原因可導(dǎo)致氣管狹窄，切除病變氣管行氣管端端吻合術(shù)是最理想的方法。但是氣管長距離大范圍缺損無法行端端吻合，就需要采用氣管重建的方法。氣管移植被認(rèn)為是氣管重建的首選方法，但同種或異種氣管移植在應(yīng)用于臨床之前面臨著諸多需要解決的問題，如供體氣管的儲存、移植后免疫排斥反應(yīng)的控制及氣管軟骨再生等。既往抑制免疫排斥反應(yīng)的主要手段是應(yīng)用免疫抑制劑，但是氣管腫瘤病人明顯不適用此種方法。由于導(dǎo)致氣管狹窄的原因當(dāng)中腫瘤是第一位的，所以尋求其他可以

2、抑制移植后免疫排斥反應(yīng)方法是近年來研究的熱點。在研究中發(fā)現(xiàn)，降低移植物抗原性可采用冷凍法和去上皮細(xì)胞法，其中深低溫冷凍法最為常用。冷凍后的組織既可以保持其原有的活性和組織完整性，又能削減其免疫原性，這樣既解決了供體的保存問題，又解決了移植后免疫排斥反應(yīng)的控制問題。但冷凍時間的長短是直接影響移植氣管是否成功的關(guān)鍵之一，過長將會降低移植物生存力，過短則達(dá)不到降低免疫排斥反應(yīng)的目的。合適冷凍時間的選擇成為解決深低溫冷凍氣管移植成功的關(guān)鍵之一。

3、
　　 目的：本實驗通過研究在深低溫(-80℃)條件下，對大鼠氣管移植體不同的冷凍保存時間后再移植到受體后的大體及病理改變，進(jìn)一步了解不同深低溫冷凍時間對大鼠氣管移植體各組織活性及免疫原性的影響（對氣管移植體的上皮、單核細(xì)胞的影響），探討同種異體大鼠氣管移植的可行性及所需凍儲的最短時間，為今后深低溫冷凍氣管移植的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。
　　 方法：切取SD大鼠氣管段后分別移入注滿冷凍保護(hù)液的凍儲管(2ml)中，放置于4℃

4、冰箱中平衡4小時，采用程控降溫儀程序降溫，降溫速率1℃/分，降至-80℃迅速投入液氮中保存。冷凍保存后，取出凍儲管置于37℃恒溫水浴箱中，輕輕搖動，使氣管段均勻快速解凍復(fù)溫。Wistar大鼠隨機(jī)分為4組，分別將冷凍10天，20天，30天后的SD大鼠5個氣管軟骨環(huán)作為供體氣管移植體，行同種異體異位移植，包埋于Wistar大鼠腹腔大網(wǎng)膜內(nèi)。于術(shù)后4周取出氣管移植體，行大體及HE染色相關(guān)病理病理學(xué)觀察，免疫組織化學(xué)法檢測各組CD3陽性細(xì)胞浸潤

5、的情況。
　　 按冷凍時間不同分為冷凍組與對照組（F組），其中冷凍10天組為C1組，冷凍20天組為C2組，冷凍30天組為C3組。
　　 組織病理采用石蠟切片HE染色觀察；免疫組化采用SP法.應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計軟件分析試驗結(jié)果。
　　 結(jié)果：
　　 1、我們采用石蠟切片HE染色方法對氣管移植組織病理進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)：SD大鼠冷凍組氣管移植體管腔通暢度優(yōu)于未冷凍組；冷凍組各組氣管移植體與未冷凍組（對照組）氣

6、管移植體相比外觀顏色略顯蒼白。在移植之前冷凍組的上皮細(xì)胞數(shù)纖毛缺失，正常的假復(fù)層柱狀纖毛上皮已經(jīng)被鱗狀上皮所取代，氣管腺幾乎失。移植4周后發(fā)現(xiàn)氣管體內(nèi)表面少量上皮覆蓋，其中少量為鱗狀上皮。F組與C1組移植4周后氣管內(nèi)可見纖毛上皮脫落明顯，主要為鱗狀上皮覆蓋，氣管腺幾乎消失。各組氣管環(huán)間、纖維外膜層及粘膜下層可見新生毛細(xì)血管生成，C2組和C3組毛細(xì)血管管腔通暢，而F組和C1組可見少量新生毛細(xì)血管內(nèi)有血栓生成。
　　 2、我們應(yīng)用免

7、疫組織化學(xué)方法，分析未冷凍及冷凍組CD3陽性細(xì)胞浸潤，根據(jù)改良的Shimizu方法著色程度積分觀察各組分別為：在F組，其陽性表達(dá)共8例，其中強(qiáng)陽性6例，陽性1例，弱陽性1例；在C1組，其陽性表達(dá)共8例，其中強(qiáng)陽性6例，陽性1例，弱陽性1例，陰性0例：在C2組，其陽性表達(dá)共8例，其中強(qiáng)陽性2例，陽性3例，弱陽性3例，陰性0例；在C3組，其陽性表達(dá)共3例，其中強(qiáng)陽性1例，陽性1例，弱陽性1例，陰性5例；結(jié)果顯示，CD陽性細(xì)胞的表達(dá)在C1組與

8、F組相比差異不顯著(P＞0.05)，在C2組、C3組表達(dá)顯著低于F組(P＜0.05)，C2組與C3組CD3陽性表達(dá)存在顯著差異(P＜0.05)，且隨著冷凍時間的延長，其表達(dá)逐漸遞減。
　　 結(jié)論：
　　 1深低溫冷凍可降低氣管移植體的抗原性，減輕移植后的免疫排斥反應(yīng)，異體異位移植后，氣管移植體管腔結(jié)構(gòu)保持良好，可長期存活。
　　 2對各組氣管移植體行術(shù)后抗原性及再上皮綜合比較，深低溫冷凍異體異位移植的最佳冷凍時間