免疫排斥與器官移植

1、第五章 免疫排斥與器官移植,移植：應用自體或異體的正常細胞、組織、器官置換病變的或功能缺損的細胞、組織、器官，以維持和重建機體生理功能的治療方法。 移植物：被移植的組織細胞或器官。供者：提供移植物的個體。受者：接受移植物的個體。,移植的類型,自體移植：指移植物取自受者自身。同系移植：指遺傳基因完全相同或基本相似個體之間的移植。同種移植：同種內遺傳基因不同的個體之間的移植。異種移植：不同種屬個體間的移植。,移植抗原,概念：引

2、起移植排斥反應的抗原類型： 1.主要組織相容性抗原 2.次要主要相容性抗原 3.血型抗原 4.組織特異性抗原,同種異型抗原的提呈與識別,直接識別：受者T細胞直接識別供者APC表面MHC分子或抗原肽-MHC分子復合物。 間接識別：受者T細胞識別經過受者APC加工處理的來源于供者MHC分子的肽。,,,直接識別 間接識別

3、,直接識別和間接識別比較,移植排斥反應的效應機制,細胞免疫應答效應機制體液免疫應答效應機制NK細胞效應機制細胞因子的效應機制,細胞免疫應答效應機制,受者CD4+ Th1細胞通過直接識別或間接識別途徑識別移植抗原并被激活，活化的T細胞釋放多種炎性細胞因子如IFN-γ、IL-2等，引起遲發(fā)型超敏反應性炎癥，還可活化CD8+ CTL，產生細胞毒效應。,體液免疫應答效應機制,抗同種異型抗原的抗體與相應抗原形成復合物，激活補體，損傷移植物。

4、抗體也可通過調理作用和ADCC作用對移植物造成損傷。,NK細胞效應機制,在同種異體移植后，受者NK細胞的KIR不能識別移植物細胞表面的同種異型MHC分子，抑制信號傳入受阻，NK細胞被激活，參與移植排斥反應。 活化T細胞分泌的多種細胞因子也可活化NK細胞，增強其殺傷活性，參與對移植物的排斥。,細胞因子的效應機制,IL-2活化同種異型反應性T細胞；IFN-γ誘導MHC分子表達，增強APC活性，激活NK細胞和巨噬細胞，參與并增強排斥

5、反應；TNF-α是導致移植物損害的重要介質；某些趨化性因子介導特定效應性T細胞聚集于移植物，并參與排斥反應發(fā)生。,同種異型移植排斥的類型,宿主抗移植物反應移植物抗宿主反應: 1.超急性排斥反應 2.急性排斥反應 3.慢性排斥反應,超急性排斥反應,概念：移植器官與受者血管接通后數分鐘至數小時內發(fā)生的排斥反應。 機制：體液免疫介導，由于受者體內預存有針對供者同種異型抗原的抗體所致。,

6、急性排斥反應,概念：發(fā)生在移植后數天至2周左右的排斥反應。機制：1.CD4+ Th1細胞介導的遲發(fā)型超敏反應和CD8+ CTL直接殺傷表達同種異型抗原的移植物細胞，引起間質細胞損害。2.機體產生的抗血管內皮細胞表面同種異型抗原的抗體與相應抗原形成免疫復合物，激活補體而損害移植物血管。3.激活的巨噬細胞和NK細胞參與移植物組織損傷。,慢性排斥反應,概念：發(fā)生于移植后數周、數月、 甚至數年的排斥反應。 機制： 1.免疫學

7、因素 2.非免疫學因素,免疫學機制,1.特異性抗體或效應細胞對微血管內皮細胞的細胞毒作用，導致血管損傷； 2.遲發(fā)型超敏反應誘使巨噬細胞分泌平滑肌細胞生長因子，導致動脈血管內平滑肌細胞，血管壁增厚，間質纖維化。,非免疫學機制,1.移植術后早期出現缺血-再灌注損傷；2.移植器官去神經支配和血管損傷等；3.免疫抑制劑的毒副作用；4.受者并發(fā)高血壓、高脂血癥、糖尿病和慢性 巨細胞病毒感染等也可導致慢性排斥反應。,,移植物抗宿

8、主反應,概念：移植物中的淋巴細胞識別宿主組織同種異型抗原而發(fā)生的一種排斥反應。 前提條件: 1.受者與供者HLA型別不相配合； 2.移植物中含有足夠數量的免疫細胞，尤其是成熟的T細胞； 3.受者處于免疫無能或免疫功能極度低下的狀態(tài),GVHR機制,T細胞是介導GVHR的主要效應細胞。骨髓移植物中成熟CD4+T細胞識別宿主的同種異型抗原，并增殖分化為效應T細胞。這些激活的效應細胞隨血流游走至受者全身，對宿主組織或器官發(fā)動免

9、疫攻擊。,供受者的配合選擇,一般情況 ABO血型相容 HLA相容性,HLA分型試驗,血清學分型法細胞學分型法基因分型法,血清學分型法,原理：CDC 應用：SD抗原（HLA-A、B、C、DR、DQ）。,技術要點,（1）分離待檢的淋巴細胞，經洗滌、計數后，配成一定濃度。檢測HLA-Ⅱ類抗原時，需分離B淋巴細胞。（2）取分型板，加入標準抗血清和待檢淋巴細胞，充分混勻，溫育。（3）加入補體，溫育。（4）加臺盼藍染色死細胞

10、。（5）用倒置顯微鏡觀察計數死細胞的百分數。,CDC試驗結果判定標準,細胞學分型法,原理：淋巴細胞增殖試驗應用：LD抗原（HLA-D、DP）類型： 1.雙向混合淋巴細胞培養(yǎng)法 2.單向混合淋巴細胞培養(yǎng)法,雙向MLC方法原理,雙向MLC中的兩種淋巴細胞既是刺激細胞又是反應細胞,彼此能發(fā)生相互作用。若彼此淋巴細胞均無形態(tài)學改變或細胞分裂增殖，說明兩個個體間HLA型別相同。若彼此淋巴細胞均發(fā)生形態(tài)學改變或細胞分裂增殖

11、，說明兩個個體間HLA型別不同。,雙向MLC方法技術要點,1.分離待檢淋巴細胞，洗滌、計數，配成一定濃度。2.反應管加雙方淋巴細胞，對照管分別加單方淋巴細胞。3.將細胞置CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)5～6天。4.取沉淀物涂片、染色，高倍鏡下計算轉化率，或在培養(yǎng)終止前16～20h加3H-TdR，培養(yǎng)后將細胞收集于濾膜，液閃儀測定cpm，計算SI。,單向MLC方法原理,單向MLC方法中的兩種淋巴細胞有刺激細胞和反應細胞之分。首先將其中一種淋

12、巴細胞用絲裂霉素處理或X線照射，使其喪失免疫反應能力，但HLA抗原不發(fā)生改變，因此被處理的細胞只作為刺激細胞，刺激細胞只能單向作用于反應細胞，它刺激另一種未處理的淋巴細胞，使其發(fā)生淋巴細胞轉化和增殖。,單向MLC方法類型,純合子分型細胞試驗：陰性分型法預致敏淋巴細胞分型試驗：陽性分型法,HTC試驗原理,HTC是只表達一種LD抗原的細胞，即同源染色體上編碼LD抗原的MHC單倍型基因相同。這種細胞經絲裂霉素C處理或X線照射后，作為刺激細胞

13、。試驗時將已知型別的HTC與待檢的淋巴細胞混合，進行單向MLC。若待檢細胞不發(fā)生增殖反應（SI<2），說明待檢細胞與HTC的HLA型別相同。因根據陰性反應作為判定標準，故HTC試驗又稱為陰性分型法；,PLT試驗原理,預致敏淋巴細胞是一種僅對一種單倍型具有識別增殖能力，而處于靜止狀態(tài)的淋巴細胞。這種細胞遇到相應抗原刺激后，可迅速發(fā)生淋巴細胞轉化和增殖。PLT試驗是將此種細胞作為已知的分型細胞。正式試驗時，將待檢淋巴細胞處理作為刺激

14、細胞，分別與一系列的預致敏淋巴細胞（反應細胞）進行單向MLC。如果待檢細胞與預致敏淋巴細胞預先識別的抗原相同，預致敏淋巴細胞會迅速增殖。因預致敏淋巴細胞分型試驗是用陽性反應作為判定標準，故PLT試驗又稱為陽性分型法。,單向MLC方法的技術要點,單向MLC方法的技術要點與雙向MLC方法類似，不同點有：①需提前篩選純合子分型細胞或制備預致敏淋巴細胞；②HTC試驗中待檢細胞不需處理，作為反應細胞，而PLT試驗中待檢細胞需進行處理，作為刺激細

15、胞；③形態(tài)學方法以轉化細胞百分率判斷淋巴細胞反應程度，一般認為轉化率小于5%為陰性；④3H-TdR摻入試驗以刺激指數（SI）判斷淋巴細胞反應程度。,基因分型法,RFLP分析法PCR-SSCP探針分型法PCR-SSP分型法PCR-SSCP PCR指紋圖譜技術,限制性片段長度多態(tài)性分析法（RFLP）,RFLP是最早建立的研究HLA多態(tài)性的基因分析技術。根據不同個體間的HLA相應堿基序列在不同部位存在多個不同酶切位點，通過一組限制

16、性內切酶消化、識別、切割這些位點，產生數量和長度不一的DNA酶解片段，經電泳分離，與相應的cDNA探針進行雜交，即可分析限制性片段長度多態(tài)性，借以確定HLA的型別，這種HLA分型法稱為DNA-RFLP。若對DNA片段進行體外擴增，然后再進行RFLP分析，則可大大提高RFLP的敏感度和特異性，這種引入DNA體外擴增技術的限制性片段長度多態(tài)性分析則稱為PCR-RFLP分型法。,PCR-SSOP,PCR-SSOP分型法是將待檢細胞HLA基因片

17、段經PCR擴增后轉移至NC膜或尼龍膜上，然后與放射性核素（32P）、生物素或地高辛等標記的SSCP探針進行雜交，若待檢DNA與已知核苷酸序列的探針互補，則兩者結合，即可分析出待檢DNA序列，據此確定HLA的基因型別。,,PCR-SSP分型法,PCR-SSP是根據HLA堿基序列的多態(tài)性和已知的DNA序列設計出一套針對每一等位基因的特異性引物，SSP 只能和相應等位基因特異片段的堿基組列互補性結合。通過PCR技術將待檢DNA擴增，產生相對應

18、的特異性擴增產物，通過電泳分析確定HLA型別。,PCR-SSCP,單鏈DNA具有在不含變性劑的中性聚丙烯酰胺凝膠電泳時，可形成一定的空間結構和構像的特點。即使長度相同的單鏈DNA其堿基順序不同，甚至單個堿基不同，所形成的構像不同，電泳時泳動速度和遷移率也不同。PCR-SSCP是指目的DNA經PCR擴增、變性后進行SSCP分析，靶DNA中堿基序列的改變會出現泳動移位。因此，若供、受者的SSCP帶型一致，則其HLA基因相匹配；若電泳帶型不一

19、致，則不匹配。,PCR指紋圖譜技術,PCR反應過程中，在特異性DNA最后一個循環(huán)的退火期，單鏈DNA互相結合形成同一個體完全互補的同質雙鏈，但某些單鏈DNA還可能與不同個體的單鏈DNA形成不完全互補的異質雙鏈。由于不同個體的DNA具有不同分子構象，在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中呈現特異的區(qū)帶圖譜，稱為PCR指紋圖譜。HLA基因分型時，將供、受體的DNA擴增產物混合，電泳后得出一指紋圖，再與二者各自的PCR指紋圖譜進行比較，根據指紋圖的一致

20、性作為選擇供者的依據。,微量細胞毒試驗,用供者的淋巴細胞做靶細胞，與受者的血清進行CDC，可檢出受者血清中是否含有針對供者淋巴細胞的抗體，以防止超急性排斥反應的發(fā)生。,流式細胞儀檢測,將供者淋巴細胞與受者血清共育后，用熒光標記的抗人Ig對結合有抗體的細胞染色，在流式細胞儀上進行熒光標記測定。該法比微量細胞毒試驗的靈敏度高100倍。,混合淋巴細胞培養(yǎng),將受者與供者的淋巴細胞做雙向混合培養(yǎng)，或者與滅活供者的淋巴細胞做單向混合培養(yǎng)，細胞發(fā)生反

21、應的程度與供、受者相容的程度呈負相關。,細胞介導的淋巴細胞毒試驗,將受者淋巴細胞與滅活的供者淋巴細胞做常規(guī)單向混合淋巴細胞培養(yǎng)，獲得致敏的受者淋巴細胞后，再與51Cr標記的、PHA刺激的供者淋巴細胞做CML試驗，51Cr釋放的程度與供、受者相容程度呈負相關。,交叉配合試驗,微量細胞毒試驗流式細胞儀檢測混合淋巴細胞培養(yǎng)細胞介導的淋巴細胞毒試驗,移植排斥的免疫學防治,一、排斥反應的監(jiān)測二、排斥反應的防治,排斥反應的監(jiān)測,細胞免疫學監(jiān)

22、測細胞因子監(jiān)測抗HLA抗體檢測蛋白、酶類、補體檢測,排斥反應的防治措施,移植抗原檢測與配型免疫抑制劑的使用移植耐受的誘導,移植抗原的檢測與配型,1、HLA的檢測 ：血清學檢測 細胞學檢測 基因檢測2、預存抗體檢測3、交叉配型,免疫抑制,1.藥物：CsA、Fk506 2. 單克隆抗體：抗CD3

23、單抗3. 血液凈化 ：去除已存在的抗體,Immunosuppressive agents,Immunosuppressive agents,TCR,,calcineurin,2+,NF-ATc,NF-ATn,NF-AT,,,,,Ca 2+,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,CsA,CyP,FK506,FKBP,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,FKBP,蛋白激酶,Rapamycin,IL-2,I

24、L-2R,輸血史對腎移植存活率的影響,移植前輸血次數 一年存活率 0 次 44% 1-4次 58% 5-9次 60% ?10次

25、 68%,,,,Blood transfusion and graft survival,,干細胞移植,干細胞：是一類具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的早期未分化細胞。,干細胞的分類,胚胎干細胞 成體干細胞,干細胞的臨床應用,作為細胞治療與組織器官替代治療的種子細胞研究胚胎發(fā)育的調控機制作為疾病基因治療的理想載體用于藥物篩選和新藥開發(fā),異種移植（xenograft）：

26、指不同種屬間的移植，是用手術的方法將某一種屬個體的器官或組織移植到另一種屬個體的某一部位。,異種移植的特殊免疫學問題,異種移植的特性,1、人體內存在針對動物細胞表面多糖分子的天然 IgM 抗體，導致超急排斥反應。2. 遲發(fā)性異種移植排斥反應可能由NK細胞和巨噬 細胞介導，涉及大量參與炎癥反應的細胞和因子， 及相關基因的激活和表達。3．急性及慢性異種移植排斥反應主要由T細胞介導。,異種移植的類型,協調

27、性 非協調性,骨髓移植的特殊免疫學問題,移植物抗宿主病（GVHD）：是指供者的免疫活性細胞與免疫功能低下的受者抗原起反應的一種疾病。,GVHD發(fā)生條件,宿主與移植物之間的組織相容性不同移植物中含有足量免疫活性細胞宿主處于免疫無能或免疫功能嚴重缺損,Graft versus host (GVH) disease,GVH反應的臨床表現類型,組織器官 急性反應 慢性反應

28、皮膚 紅皮病 硬皮病 毛囊炎 丘疹性皮炎 脫屑 脫發(fā)肝臟 肝功能異常

29、 膽汁性肝硬化消化道 腹瀉、腸梗阻 黏膜結構破壞 腸隱窩炎淋巴結 遲發(fā)性細胞增生 T、B細胞耗竭,,,,GVH disease in humans,本章小結,1、移植與移植免疫的概念2、移植抗原的基本概念與類型3、HVG與GVH的反應機制與類型4、移植排斥反應的免

30、疫學特點5、移植排斥反應的防治措施,68,,免疫網站,Immunology http://medmark.org/imm/Medweb:Immunology http://www.gen.emory.edu/medweb/medweb.immumology.htmlNational Jewish Medical and Research Center http://www.njc.oryAll about