免疫排斥與器官移植

1、第五章 免疫排斥與器官移植,移植：應(yīng)用自體或異體的正常細(xì)胞、組織、器官置換病變的或功能缺損的細(xì)胞、組織、器官，以維持和重建機體生理功能的治療方法。 移植物：被移植的組織細(xì)胞或器官。供者：提供移植物的個體。受者：接受移植物的個體。,移植的類型,自體移植：指移植物取自受者自身。同系移植：指遺傳基因完全相同或基本相似個體之間的移植。同種移植：同種內(nèi)遺傳基因不同的個體之間的移植。異種移植：不同種屬個體間的移植。,移植抗原,概念：引

2、起移植排斥反應(yīng)的抗原類型： 1.主要組織相容性抗原 2.次要主要相容性抗原 3.血型抗原 4.組織特異性抗原,同種異型抗原的提呈與識別,直接識別：受者T細(xì)胞直接識別供者APC表面MHC分子或抗原肽-MHC分子復(fù)合物。 間接識別：受者T細(xì)胞識別經(jīng)過受者APC加工處理的來源于供者M(jìn)HC分子的肽。,,,直接識別 間接識別

3、,直接識別和間接識別比較,移植排斥反應(yīng)的效應(yīng)機制,細(xì)胞免疫應(yīng)答效應(yīng)機制體液免疫應(yīng)答效應(yīng)機制NK細(xì)胞效應(yīng)機制細(xì)胞因子的效應(yīng)機制,細(xì)胞免疫應(yīng)答效應(yīng)機制,受者CD4+ Th1細(xì)胞通過直接識別或間接識別途徑識別移植抗原并被激活，活化的T細(xì)胞釋放多種炎性細(xì)胞因子如IFN-γ、IL-2等，引起遲發(fā)型超敏反應(yīng)性炎癥，還可活化CD8+ CTL，產(chǎn)生細(xì)胞毒效應(yīng)。,體液免疫應(yīng)答效應(yīng)機制,抗同種異型抗原的抗體與相應(yīng)抗原形成復(fù)合物，激活補體，損傷移植物。

4、抗體也可通過調(diào)理作用和ADCC作用對移植物造成損傷。,NK細(xì)胞效應(yīng)機制,在同種異體移植后，受者NK細(xì)胞的KIR不能識別移植物細(xì)胞表面的同種異型MHC分子，抑制信號傳入受阻，NK細(xì)胞被激活，參與移植排斥反應(yīng)。 活化T細(xì)胞分泌的多種細(xì)胞因子也可活化NK細(xì)胞，增強其殺傷活性，參與對移植物的排斥。,細(xì)胞因子的效應(yīng)機制,IL-2活化同種異型反應(yīng)性T細(xì)胞；IFN-γ誘導(dǎo)MHC分子表達(dá)，增強APC活性，激活NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，參與并增強排斥

5、反應(yīng)；TNF-α是導(dǎo)致移植物損害的重要介質(zhì)；某些趨化性因子介導(dǎo)特定效應(yīng)性T細(xì)胞聚集于移植物，并參與排斥反應(yīng)發(fā)生。,同種異型移植排斥的類型,宿主抗移植物反應(yīng)移植物抗宿主反應(yīng): 1.超急性排斥反應(yīng) 2.急性排斥反應(yīng) 3.慢性排斥反應(yīng),超急性排斥反應(yīng),概念：移植器官與受者血管接通后數(shù)分鐘至數(shù)小時內(nèi)發(fā)生的排斥反應(yīng)。 機制：體液免疫介導(dǎo)，由于受者體內(nèi)預(yù)存有針對供者同種異型抗原的抗體所致。,

6、急性排斥反應(yīng),概念：發(fā)生在移植后數(shù)天至2周左右的排斥反應(yīng)。機制：1.CD4+ Th1細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)和CD8+ CTL直接殺傷表達(dá)同種異型抗原的移植物細(xì)胞，引起間質(zhì)細(xì)胞損害。2.機體產(chǎn)生的抗血管內(nèi)皮細(xì)胞表面同種異型抗原的抗體與相應(yīng)抗原形成免疫復(fù)合物，激活補體而損害移植物血管。3.激活的巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞參與移植物組織損傷。,慢性排斥反應(yīng),概念：發(fā)生于移植后數(shù)周、數(shù)月、 甚至數(shù)年的排斥反應(yīng)。 機制： 1.免疫學(xué)

7、因素 2.非免疫學(xué)因素,免疫學(xué)機制,1.特異性抗體或效應(yīng)細(xì)胞對微血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，導(dǎo)致血管損傷； 2.遲發(fā)型超敏反應(yīng)誘使巨噬細(xì)胞分泌平滑肌細(xì)胞生長因子，導(dǎo)致動脈血管內(nèi)平滑肌細(xì)胞，血管壁增厚，間質(zhì)纖維化。,非免疫學(xué)機制,1.移植術(shù)后早期出現(xiàn)缺血-再灌注損傷；2.移植器官去神經(jīng)支配和血管損傷等；3.免疫抑制劑的毒副作用；4.受者并發(fā)高血壓、高脂血癥、糖尿病和慢性 巨細(xì)胞病毒感染等也可導(dǎo)致慢性排斥反應(yīng)。,,移植物抗宿

8、主反應(yīng),概念：移植物中的淋巴細(xì)胞識別宿主組織同種異型抗原而發(fā)生的一種排斥反應(yīng)。 前提條件: 1.受者與供者HLA型別不相配合； 2.移植物中含有足夠數(shù)量的免疫細(xì)胞，尤其是成熟的T細(xì)胞； 3.受者處于免疫無能或免疫功能極度低下的狀態(tài),GVHR機制,T細(xì)胞是介導(dǎo)GVHR的主要效應(yīng)細(xì)胞。骨髓移植物中成熟CD4+T細(xì)胞識別宿主的同種異型抗原，并增殖分化為效應(yīng)T細(xì)胞。這些激活的效應(yīng)細(xì)胞隨血流游走至受者全身，對宿主組織或器官發(fā)動免

9、疫攻擊。,供受者的配合選擇,一般情況 ABO血型相容 HLA相容性,HLA分型試驗,血清學(xué)分型法細(xì)胞學(xué)分型法基因分型法,血清學(xué)分型法,原理：CDC 應(yīng)用：SD抗原（HLA-A、B、C、DR、DQ）。,技術(shù)要點,（1）分離待檢的淋巴細(xì)胞，經(jīng)洗滌、計數(shù)后，配成一定濃度。檢測HLA-Ⅱ類抗原時，需分離B淋巴細(xì)胞。（2）取分型板，加入標(biāo)準(zhǔn)抗血清和待檢淋巴細(xì)胞，充分混勻，溫育。（3）加入補體，溫育。（4）加臺盼藍(lán)染色死細(xì)胞

10、。（5）用倒置顯微鏡觀察計數(shù)死細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。,CDC試驗結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn),細(xì)胞學(xué)分型法,原理：淋巴細(xì)胞增殖試驗應(yīng)用：LD抗原（HLA-D、DP）類型： 1.雙向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)法 2.單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)法,雙向MLC方法原理,雙向MLC中的兩種淋巴細(xì)胞既是刺激細(xì)胞又是反應(yīng)細(xì)胞,彼此能發(fā)生相互作用。若彼此淋巴細(xì)胞均無形態(tài)學(xué)改變或細(xì)胞分裂增殖，說明兩個個體間HLA型別相同。若彼此淋巴細(xì)胞均發(fā)生形態(tài)學(xué)改變或細(xì)胞分裂增殖

11、，說明兩個個體間HLA型別不同。,雙向MLC方法技術(shù)要點,1.分離待檢淋巴細(xì)胞，洗滌、計數(shù)，配成一定濃度。2.反應(yīng)管加雙方淋巴細(xì)胞，對照管分別加單方淋巴細(xì)胞。3.將細(xì)胞置CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)5～6天。4.取沉淀物涂片、染色，高倍鏡下計算轉(zhuǎn)化率，或在培養(yǎng)終止前16～20h加3H-TdR，培養(yǎng)后將細(xì)胞收集于濾膜，液閃儀測定cpm，計算SI。,單向MLC方法原理,單向MLC方法中的兩種淋巴細(xì)胞有刺激細(xì)胞和反應(yīng)細(xì)胞之分。首先將其中一種淋

12、巴細(xì)胞用絲裂霉素處理或X線照射，使其喪失免疫反應(yīng)能力，但HLA抗原不發(fā)生改變，因此被處理的細(xì)胞只作為刺激細(xì)胞，刺激細(xì)胞只能單向作用于反應(yīng)細(xì)胞，它刺激另一種未處理的淋巴細(xì)胞，使其發(fā)生淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和增殖。,單向MLC方法類型,純合子分型細(xì)胞試驗：陰性分型法預(yù)致敏淋巴細(xì)胞分型試驗：陽性分型法,HTC試驗原理,HTC是只表達(dá)一種LD抗原的細(xì)胞，即同源染色體上編碼LD抗原的MHC單倍型基因相同。這種細(xì)胞經(jīng)絲裂霉素C處理或X線照射后，作為刺激細(xì)胞

13、。試驗時將已知型別的HTC與待檢的淋巴細(xì)胞混合，進(jìn)行單向MLC。若待檢細(xì)胞不發(fā)生增殖反應(yīng)（SI<2），說明待檢細(xì)胞與HTC的HLA型別相同。因根據(jù)陰性反應(yīng)作為判定標(biāo)準(zhǔn)，故HTC試驗又稱為陰性分型法；,PLT試驗原理,預(yù)致敏淋巴細(xì)胞是一種僅對一種單倍型具有識別增殖能力，而處于靜止?fàn)顟B(tài)的淋巴細(xì)胞。這種細(xì)胞遇到相應(yīng)抗原刺激后，可迅速發(fā)生淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和增殖。PLT試驗是將此種細(xì)胞作為已知的分型細(xì)胞。正式試驗時，將待檢淋巴細(xì)胞處理作為刺激

14、細(xì)胞，分別與一系列的預(yù)致敏淋巴細(xì)胞（反應(yīng)細(xì)胞）進(jìn)行單向MLC。如果待檢細(xì)胞與預(yù)致敏淋巴細(xì)胞預(yù)先識別的抗原相同，預(yù)致敏淋巴細(xì)胞會迅速增殖。因預(yù)致敏淋巴細(xì)胞分型試驗是用陽性反應(yīng)作為判定標(biāo)準(zhǔn)，故PLT試驗又稱為陽性分型法。,單向MLC方法的技術(shù)要點,單向MLC方法的技術(shù)要點與雙向MLC方法類似，不同點有：①需提前篩選純合子分型細(xì)胞或制備預(yù)致敏淋巴細(xì)胞；②HTC試驗中待檢細(xì)胞不需處理，作為反應(yīng)細(xì)胞，而PLT試驗中待檢細(xì)胞需進(jìn)行處理，作為刺激細(xì)

15、胞；③形態(tài)學(xué)方法以轉(zhuǎn)化細(xì)胞百分率判斷淋巴細(xì)胞反應(yīng)程度，一般認(rèn)為轉(zhuǎn)化率小于5%為陰性；④3H-TdR摻入試驗以刺激指數(shù)（SI）判斷淋巴細(xì)胞反應(yīng)程度。,基因分型法,RFLP分析法PCR-SSCP探針分型法PCR-SSP分型法PCR-SSCP PCR指紋圖譜技術(shù),限制性片段長度多態(tài)性分析法（RFLP）,RFLP是最早建立的研究HLA多態(tài)性的基因分析技術(shù)。根據(jù)不同個體間的HLA相應(yīng)堿基序列在不同部位存在多個不同酶切位點，通過一組限制

16、性內(nèi)切酶消化、識別、切割這些位點，產(chǎn)生數(shù)量和長度不一的DNA酶解片段，經(jīng)電泳分離，與相應(yīng)的cDNA探針進(jìn)行雜交，即可分析限制性片段長度多態(tài)性，借以確定HLA的型別，這種HLA分型法稱為DNA-RFLP。若對DNA片段進(jìn)行體外擴(kuò)增，然后再進(jìn)行RFLP分析，則可大大提高RFLP的敏感度和特異性，這種引入DNA體外擴(kuò)增技術(shù)的限制性片段長度多態(tài)性分析則稱為PCR-RFLP分型法。,PCR-SSOP,PCR-SSOP分型法是將待檢細(xì)胞HLA基因片

17、段經(jīng)PCR擴(kuò)增后轉(zhuǎn)移至NC膜或尼龍膜上，然后與放射性核素（32P）、生物素或地高辛等標(biāo)記的SSCP探針進(jìn)行雜交，若待檢DNA與已知核苷酸序列的探針互補，則兩者結(jié)合，即可分析出待檢DNA序列，據(jù)此確定HLA的基因型別。,,PCR-SSP分型法,PCR-SSP是根據(jù)HLA堿基序列的多態(tài)性和已知的DNA序列設(shè)計出一套針對每一等位基因的特異性引物，SSP 只能和相應(yīng)等位基因特異片段的堿基組列互補性結(jié)合。通過PCR技術(shù)將待檢DNA擴(kuò)增，產(chǎn)生相對應(yīng)

18、的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，通過電泳分析確定HLA型別。,PCR-SSCP,單鏈DNA具有在不含變性劑的中性聚丙烯酰胺凝膠電泳時，可形成一定的空間結(jié)構(gòu)和構(gòu)像的特點。即使長度相同的單鏈DNA其堿基順序不同，甚至單個堿基不同，所形成的構(gòu)像不同，電泳時泳動速度和遷移率也不同。PCR-SSCP是指目的DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增、變性后進(jìn)行SSCP分析，靶DNA中堿基序列的改變會出現(xiàn)泳動移位。因此，若供、受者的SSCP帶型一致，則其HLA基因相匹配；若電泳帶型不一

19、致，則不匹配。,PCR指紋圖譜技術(shù),PCR反應(yīng)過程中，在特異性DNA最后一個循環(huán)的退火期，單鏈DNA互相結(jié)合形成同一個體完全互補的同質(zhì)雙鏈，但某些單鏈DNA還可能與不同個體的單鏈DNA形成不完全互補的異質(zhì)雙鏈。由于不同個體的DNA具有不同分子構(gòu)象，在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中呈現(xiàn)特異的區(qū)帶圖譜，稱為PCR指紋圖譜。HLA基因分型時，將供、受體的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物混合，電泳后得出一指紋圖，再與二者各自的PCR指紋圖譜進(jìn)行比較，根據(jù)指紋圖的一致

20、性作為選擇供者的依據(jù)。,微量細(xì)胞毒試驗,用供者的淋巴細(xì)胞做靶細(xì)胞，與受者的血清進(jìn)行CDC，可檢出受者血清中是否含有針對供者淋巴細(xì)胞的抗體，以防止超急性排斥反應(yīng)的發(fā)生。,流式細(xì)胞儀檢測,將供者淋巴細(xì)胞與受者血清共育后，用熒光標(biāo)記的抗人Ig對結(jié)合有抗體的細(xì)胞染色，在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行熒光標(biāo)記測定。該法比微量細(xì)胞毒試驗的靈敏度高100倍。,混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng),將受者與供者的淋巴細(xì)胞做雙向混合培養(yǎng)，或者與滅活供者的淋巴細(xì)胞做單向混合培養(yǎng)，細(xì)胞發(fā)生反

21、應(yīng)的程度與供、受者相容的程度呈負(fù)相關(guān)。,細(xì)胞介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞毒試驗,將受者淋巴細(xì)胞與滅活的供者淋巴細(xì)胞做常規(guī)單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)，獲得致敏的受者淋巴細(xì)胞后，再與51Cr標(biāo)記的、PHA刺激的供者淋巴細(xì)胞做CML試驗，51Cr釋放的程度與供、受者相容程度呈負(fù)相關(guān)。,交叉配合試驗,微量細(xì)胞毒試驗流式細(xì)胞儀檢測混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞毒試驗,移植排斥的免疫學(xué)防治,一、排斥反應(yīng)的監(jiān)測二、排斥反應(yīng)的防治,排斥反應(yīng)的監(jiān)測,細(xì)胞免疫學(xué)監(jiān)

22、測細(xì)胞因子監(jiān)測抗HLA抗體檢測蛋白、酶類、補體檢測,排斥反應(yīng)的防治措施,移植抗原檢測與配型免疫抑制劑的使用移植耐受的誘導(dǎo),移植抗原的檢測與配型,1、HLA的檢測 ：血清學(xué)檢測 細(xì)胞學(xué)檢測 基因檢測2、預(yù)存抗體檢測3、交叉配型,免疫抑制,1.藥物：CsA、Fk506 2. 單克隆抗體：抗CD3

23、單抗3. 血液凈化 ：去除已存在的抗體,Immunosuppressive agents,Immunosuppressive agents,TCR,,calcineurin,2+,NF-ATc,NF-ATn,NF-AT,,,,,Ca 2+,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,CsA,CyP,FK506,FKBP,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,FKBP,蛋白激酶,Rapamycin,IL-2,I

24、L-2R,輸血史對腎移植存活率的影響,移植前輸血次數(shù) 一年存活率 0 次 44% 1-4次 58% 5-9次 60% ?10次

25、 68%,,,,Blood transfusion and graft survival,,干細(xì)胞移植,干細(xì)胞：是一類具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的早期未分化細(xì)胞。,干細(xì)胞的分類,胚胎干細(xì)胞 成體干細(xì)胞,干細(xì)胞的臨床應(yīng)用,作為細(xì)胞治療與組織器官替代治療的種子細(xì)胞研究胚胎發(fā)育的調(diào)控機制作為疾病基因治療的理想載體用于藥物篩選和新藥開發(fā),異種移植（xenograft）：

26、指不同種屬間的移植，是用手術(shù)的方法將某一種屬個體的器官或組織移植到另一種屬個體的某一部位。,異種移植的特殊免疫學(xué)問題,異種移植的特性,1、人體內(nèi)存在針對動物細(xì)胞表面多糖分子的天然 IgM 抗體，導(dǎo)致超急排斥反應(yīng)。2. 遲發(fā)性異種移植排斥反應(yīng)可能由NK細(xì)胞和巨噬 細(xì)胞介導(dǎo)，涉及大量參與炎癥反應(yīng)的細(xì)胞和因子， 及相關(guān)基因的激活和表達(dá)。3．急性及慢性異種移植排斥反應(yīng)主要由T細(xì)胞介導(dǎo)。,異種移植的類型,協(xié)調(diào)

27、性 非協(xié)調(diào)性,骨髓移植的特殊免疫學(xué)問題,移植物抗宿主病（GVHD）：是指供者的免疫活性細(xì)胞與免疫功能低下的受者抗原起反應(yīng)的一種疾病。,GVHD發(fā)生條件,宿主與移植物之間的組織相容性不同移植物中含有足量免疫活性細(xì)胞宿主處于免疫無能或免疫功能嚴(yán)重缺損,Graft versus host (GVH) disease,GVH反應(yīng)的臨床表現(xiàn)類型,組織器官 急性反應(yīng) 慢性反應(yīng)

28、皮膚 紅皮病 硬皮病 毛囊炎 丘疹性皮炎 脫屑 脫發(fā)肝臟 肝功能異常

29、 膽汁性肝硬化消化道 腹瀉、腸梗阻 黏膜結(jié)構(gòu)破壞 腸隱窩炎淋巴結(jié) 遲發(fā)性細(xì)胞增生 T、B細(xì)胞耗竭,,,,GVH disease in humans,本章小結(jié),1、移植與移植免疫的概念2、移植抗原的基本概念與類型3、HVG與GVH的反應(yīng)機制與類型4、移植排斥反應(yīng)的免

30、疫學(xué)特點5、移植排斥反應(yīng)的防治措施,68,,免疫網(wǎng)站,Immunology http://medmark.org/imm/Medweb:Immunology http://www.gen.emory.edu/medweb/medweb.immumology.htmlNational Jewish Medical and Research Center http://www.njc.oryAll about