不同濃度七氟醚對樹突狀細胞啟動細胞免疫應(yīng)答的影響.pdf

1、目的:七氟醚(Sevoflurane)是一種新型的鹵族吸入麻醉藥,目前已較廣泛地應(yīng)用于臨床麻醉的多個領(lǐng)域,是一種較為安全理想的吸入麻醉藥物。樹突狀細胞(Dendritic cells,DC)是機體功能最強的抗原遞呈細胞(Amigen presenting cells,APC),它分為未成熟型DC(imDCs)和成熟型DC(mDCs),后者能表達高水平MHC分子(主要組織相容性復(fù)合體)、共刺激因子及某些粘附因子,能有效激活初始型T細胞,處

2、于啟動、調(diào)控、并維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。本實驗旨在觀察不同濃度七氟醚對mDCs作用相同時間后,對mDCs細胞形態(tài)、細胞表面免疫表型及功能的影響,進一步探討不同濃度七氟醚對mDCs啟動特異性免疫應(yīng)答的影響。
　　 方法:無菌條件下采集健康孕婦正常新生兒臍帶血70ml左右,肝素抗凝。在超凈工作臺中用生理鹽水:臍帶血為1:1比例稀釋后,再按照稀釋血:淋巴細胞分離液以2:1的比例緩緩加到淋巴細胞分離液上層,密度梯度離心法獲得臍血單個核細

3、胞(CBMC)。將CBMC用生理鹽水清洗3次后棄上清,加入無血清培養(yǎng)基重懸并計數(shù)CBMC,調(diào)整CBMC密度為2×106/ml,接種于6孔培養(yǎng)板的一孔內(nèi),容積為3ml。在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中孵育2h,移去懸浮細胞。無血清培養(yǎng)基輕輕洗滌兩次,去除殘留非貼壁細胞,保留貼壁細胞,調(diào)整細胞終濃度為1×106/ml。在PBMC中加入細胞生長因子:重組人類粒細胞集落刺激因子(rhGM-CSF)50ng/ml,人類白介素-4(rhIL-4)10n

4、g/ml。然后隨機分組:常規(guī)培養(yǎng)組作為對照組(N組)、4％的七氟醚處理組(A組)、6％的七氟醚處理組(B組)、8％的七氟醚處理組(C組)。各組均常規(guī)加入rhGM-CS、rhIL-4及重組人類腫瘤壞死因子-α(rhTNF-α)培養(yǎng)14d成為mDCs。A組、B組和C組在第14天分別用4％、6％、8％濃度的七氟醚處理2小時,N組作為對照不做處理。培養(yǎng)過程中在倒置顯微鏡下觀察DC生長情況及形態(tài)學(xué)變化。第15天收集mDCs用流式細胞分析儀分析各組

5、mDCs免疫表型CD80、CD86、CD83、HLA-DR(MHC-Ⅱ類分子之一)分子的表達;并收集各組細胞培養(yǎng)上清液用雙抗體夾心免疫(ELISA)法測定IL-12的濃度。同上述方法制備外周血CBMC,加入含有10％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液,在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h,收集懸浮細胞培養(yǎng)24h即為臍血來源的淋巴細胞,調(diào)整細胞濃度為1.0×106/ml,作為同種異體混合淋巴細胞反應(yīng)實驗中的反應(yīng)細胞,以培養(yǎng)至第15d的各組mDCs作為刺激細胞

6、,用四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測mDCs刺激混合淋巴細胞的增殖能力。
　　 結(jié)果:
　　 1:七氟醚對mDCs細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響:與N組相比,A組、B組和C組細胞形態(tài)無明顯變化,仍然具有mDCs的典型特征,掃描電鏡觀察細胞表面形態(tài)也無明顯改變;透射電鏡下,A組、B組和C組與對照N組比較,細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)無顯著變化。
　　 2:七氟醚對mDCs免疫表型表達率的影響:各組mDCs表面CD80/CD86、CD83/HLA

7、-DR表達率檢測結(jié)果均數(shù)如下:N組分別為40.72±7.74％,21.92±4.39％;A組分別為43.07±7.59％,20.64±7.26％;B組分別為47.72±6.54％,21.59±2.15％;C組分別為39.04±1.69％;27.16±8.7996。與N組比較,A組、B組、C組mDCs表面表型CD80/CD86、CD83/HLA-DR表達無明顯變化(P＞0.05)。
　　 3:七氟醚對mDCs分泌IL-12的影響:

8、各組mDCs分泌IL-12檢測結(jié)果均數(shù)如下:N組為843.89±235.57 pg/ml;A組為808.62±495.82pg/ml;B組為1396.11±293.29 pg/ml;C組為1282.38±400.58 pg/ml。A組、B組、C組mDCs分泌IL-12的濃度與N組相比無明顯差異(P＞0.05)。
　　 4:七氟醚處理后樹突狀細胞刺激混合淋巴細胞增殖反應(yīng)的影響:A組、B組和C組mDCs刺激混合淋巴細胞增殖反應(yīng)與N組