嚴(yán)重創(chuàng)傷對細(xì)胞免疫和樹突狀細(xì)胞的影響及其意義.pdf

1、本課題主要以創(chuàng)傷后的動物為研究對象，研究創(chuàng)傷后DC生物學(xué)功能的變化及其與創(chuàng)傷后細(xì)胞免疫紊亂的關(guān)系并探索其發(fā)生機(jī)制，具有一定理論意義和創(chuàng)新性，同時也可能為扭轉(zhuǎn)這種免疫紊亂提供新的治療策略，為開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的基于DC的免疫療法打下一定的基礎(chǔ)。 主要研究內(nèi)容和結(jié)果： 1．創(chuàng)傷后細(xì)胞免疫功能的評價 采用小鼠定量失血合并雙股骨骨折的創(chuàng)傷模型，在傷后不同時間分別用 2,4-二硝基氟苯(DNFB)或異硫氰酸熒光素(FIT

2、C)致敏，導(dǎo)致遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)，以DTH反應(yīng)程度來評價創(chuàng)傷后的細(xì)胞免疫功能。此外，用流式細(xì)胞儀檢測FITC致敏后的腹股溝淋巴結(jié)細(xì)胞中的FITC陽性細(xì)胞及其表面分子CD11c和MHC Ⅱ，分析DC對FITC的抗原提呈能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷后隨時間增加，小鼠的DTH反應(yīng)開始逐漸下降，到傷后24 h時下降到最低點(幾乎僅為正常對照組的一半)，24h后DTH反應(yīng)開始回升，到傷后7天時上升到與正常對照組幾乎沒有差別的程度；而流式細(xì)胞分析表明，

3、創(chuàng)傷小鼠的腹股溝淋巴結(jié)中的 FITC 陽性細(xì)胞，F(xiàn)ITC 和CD11c雙陽性細(xì)胞(攜帶FIT℃的DC)以及FITC、CD11c和MHC Class Ⅱ三陽性細(xì)胞 (攜帶FITC的成熟DC)的含量都比正常小鼠大幅度降低(P<0.01)。這些結(jié)果說明創(chuàng)傷對細(xì)胞免疫有抑制作用，削弱了機(jī)體的防御能力，而其主要原因是創(chuàng)傷后小鼠的DC向引流淋巴結(jié)細(xì)胞提呈抗原(FITC或DNFB)的能力明顯下降。 2．淋巴結(jié)細(xì)胞和DC在同種動物間過繼性轉(zhuǎn)移免

4、疫應(yīng)答的能力 在DNFB致敏的早期或晚期，將致敏小鼠的腹股溝淋巴結(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至正常小鼠，并測定該正常小鼠的DTH反應(yīng)，以此評價淋巴結(jié)細(xì)胞和DC對DTH反應(yīng)的過繼性轉(zhuǎn)移能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在早期(致敏后 1 天)的細(xì)胞轉(zhuǎn)移實驗中，與對照組(接受正常小鼠淋巴結(jié)細(xì)胞的小鼠)相比，接受創(chuàng)傷后24小時小鼠淋巴結(jié)細(xì)胞的小鼠的DTH反應(yīng)顯著降低(P<0.01)，接受正常和創(chuàng)傷小鼠等量混合的淋巴結(jié)細(xì)胞(其總數(shù)量為未混合細(xì)胞的2倍)的小鼠的耳腫程度顯著提

5、高(P<0.01)；在晚期(致敏后 5 天)的細(xì)胞轉(zhuǎn)移實驗中，雖然接受混合淋巴結(jié)細(xì)胞的小鼠的耳腫程度顯著高于接受創(chuàng)傷后24小時小鼠淋巴結(jié)細(xì)胞的小鼠，但是兩者均顯著低于接受正常小鼠淋巴結(jié)細(xì)胞的小鼠(P<0.01)。由于DTH反應(yīng)的過程中，早期(致敏后1～2天)的淋巴結(jié)細(xì)胞過繼性轉(zhuǎn)移DTH的能力反映了淋巴結(jié)中DC的抗原提呈能力；而晚期(致敏后4～5天)的淋巴結(jié)細(xì)胞過繼性轉(zhuǎn)移DTH的能力反映了淋巴結(jié)中T細(xì)胞的致敏能力，因此這些結(jié)果說明創(chuàng)傷抑制

6、了DC在體內(nèi)的抗原提呈功能，導(dǎo)致其過繼性轉(zhuǎn)移：DTH的能力下降。 3．DC的分離和純化 采用 14％Nycodenz密度梯度離心法分離純化脾樹突狀細(xì)胞。制備脾細(xì)胞懸液并經(jīng)過離心后，結(jié)果可收集到占總細(xì)胞數(shù)3％～5％的低密度細(xì)胞即為 DC。 4．DC的體外抗原提呈功能 采用混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，在伴清蛋白作為抗原存在的條件下，檢測脾非黏附細(xì)胞在脾DC刺激下的增殖情況以及1-甲基色氨酸(1-methyl trypt

7、ophan，1-MT)對這種增殖的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常小鼠脾非黏附細(xì)胞的增殖指數(shù)(PI)明顯高于創(chuàng)傷組小鼠(P<0.1)，這表明創(chuàng)傷小鼠的脾DC在體外刺激脾非黏附細(xì)胞增殖的能力比正常小鼠有所下降。此外，在這一抗原提呈過程中，1-MT對脾DC刺激脾非黏附細(xì)胞的增殖也有一定的影響，1-MT在低濃度60 μM時對非黏附細(xì)胞增殖沒有明顯影響，但隨著濃度升高，1-MT誘導(dǎo)脾非黏附細(xì)胞的增殖加強(qiáng)，到600μM時，其誘導(dǎo)創(chuàng)傷小鼠脾非黏附細(xì)胞的增殖比對照

8、組(無1-MT)有顯著提高(P<0.05)，但1-MT對正常小鼠脾非黏附細(xì)胞增殖的影響始終不顯著。 5．DC體外分泌細(xì)胞因子的功能 用ELISA 方法檢測脾DC在體外抗原提呈過程中以及脾DC與內(nèi)毒素在體外共培養(yǎng)不同時間的過程中細(xì)胞因子IL-10和IL-12的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷小鼠脾DC在抗原提呈過程中分泌的IL-12比正常小鼠明顯降低(P<0.05)，IL-10則無明顯差別；而脾DC與內(nèi)毒素共培養(yǎng)過程中，創(chuàng)傷小鼠脾DC分

9、泌的IL-12比正常小鼠明顯升高(P<0.05)，IL-10則比正常小鼠明顯降低(P<0.05)。 6．DC數(shù)量、表型和其共刺激分子表達(dá)的變化 用流式細(xì)胞儀檢測脾、胸腺、肺、腹股溝淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞表面分子CD11c、MHC Ⅱ、CD40、CD80和CD86，分析總DC(CD11c<'+>)，未成熟DC(CD11c<'+>/MHC Ⅱ<'->)和成熟DC (CD11c<'+>/MHC Ⅱ<'+>)及其共刺激分子CD

10、40，CD80和CD86的表達(dá)。結(jié)果表明創(chuàng)傷24 h后，胸腺和肺的總DC，成熟DC和未成熟DC的數(shù)量，以及共刺激分子CD40、CD80和CD86的表達(dá)與正常對照組相比都沒有顯著變化；脾DC的總數(shù)和其共刺激分子CD40、CD80和CD86的表達(dá)沒有明顯變化，但創(chuàng)傷后脾成熟DC比正常組顯著減少 (P<0.05)，未成熟DC則顯著增多(P<0.05)；創(chuàng)傷后腹股溝淋巴結(jié)DC共刺激分子CD40、CD80和CD86的表達(dá)沒有明顯變化，但其總數(shù)量，

11、成熟DC和未成熟DC的數(shù)量比正常組均顯著降低(P<0.01)；腸系膜淋巴結(jié)DC的共刺激分子CD40、CD80和CD86的表達(dá)在創(chuàng)傷后也沒有明顯變化，而其總數(shù)量，成熟 DC 和未成熟DC的數(shù)量也都比正常組顯著下降(P<0.01)。 7．初步探索促進(jìn)創(chuàng)傷恢復(fù)的措施 (1) 補(bǔ)充淋巴結(jié)細(xì)胞對創(chuàng)傷后DTH反應(yīng)的作用 制備小鼠天然的或致敏的腹股溝淋巴結(jié)細(xì)胞，將其注入創(chuàng)傷小鼠體內(nèi)，隨后測定該小鼠的DTH反應(yīng)。結(jié)果顯示不論是補(bǔ)

12、充未致敏的正常小鼠腹股溝淋巴結(jié)細(xì)胞，還是致敏后1天的正常小鼠腹股溝淋巴結(jié)細(xì)胞，還是傷后24小時再致敏1天的小鼠腹股溝淋巴結(jié)細(xì)胞，都對創(chuàng)傷后24小時的小鼠的。DTH 反應(yīng)有明顯增強(qiáng)作用，幾乎都能增強(qiáng)到正常小鼠的DTH反應(yīng)水平。這說明補(bǔ)充淋巴結(jié)細(xì)胞對促進(jìn)創(chuàng)傷后細(xì)胞免疫的恢復(fù)有一定作用，從而增強(qiáng)了創(chuàng)傷后機(jī)體的防御能力。 (2) 靶向核因子(NF) -κB p50 亞基穿膜拮抗肽對急性炎癥的作用 創(chuàng)傷后炎癥因子活性增加，容易造成

13、過度甚至失控性炎癥，并由此引起嚴(yán)重并發(fā)癥和高死亡率，因此及時的抗炎措施是必要的。由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所一室的徐祥博士設(shè)計并制備的靶向 NF-κB p50 亞基穿膜拮抗肽在體外的實驗中已顯示其抗炎的潛力，為了進(jìn)一步評價其抗炎功能，我們采用了豆蔻酸一佛波醇-乙酸酯 (PMA) 誘導(dǎo)的小鼠耳腫 (測定耳厚度和觀察耳病理切片) 和酵母多糖 A 刺激的小鼠腹膜炎 (計數(shù)腹腔內(nèi)炎性細(xì)胞數(shù)量和測定腹腔灌洗液中炎性細(xì)胞因子的水平) 兩個急