豬樹突狀細(xì)胞在豬鏈球菌2型感染致炎癥風(fēng)暴中的作用研究.pdf

1、豬鏈球菌病是由豬鏈球菌(Streptocuccus suis，SS)引起的對世界許多國家養(yǎng)豬業(yè)造成極大危害的人畜共患病。在已知的35種豬鏈球菌血清型中，毒性最強(qiáng)，研究最多的為豬鏈球菌2型(Streptocuccus suis serotype2，SS2)。我國有兩次較大規(guī)模的2型豬鏈球菌病的爆發(fā)，分別發(fā)生在江蘇省部分地區(qū)(1998)和四川省資陽地區(qū)(2005)，不僅對養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，還導(dǎo)致了數(shù)百人感染、數(shù)十人死亡。
　　豬

2、感染豬鏈球菌2型后在短時(shí)間內(nèi)迅速出現(xiàn)腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、肺炎等，嚴(yán)重的甚至死亡，表現(xiàn)出明顯的炎癥風(fēng)暴癥狀。但目前對豬鏈球菌致病機(jī)理的研究多集中在腦膜腦炎的發(fā)生機(jī)制上，對豬鏈球菌侵入機(jī)體后如何導(dǎo)致炎癥風(fēng)暴，從而致死動(dòng)物或人還不是十分清楚。樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells，DCs)是呈遞抗原能力最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞(Antigen-presenting cells，APCs)。DC受不同類型抗原刺激后分泌不同類型的細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)機(jī)體的炎

3、癥反應(yīng)、誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞向不同的方向定向分化，在非特異性免疫應(yīng)答和特異性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。然而，豬的DC在豬鏈球菌感染后產(chǎn)生的炎癥風(fēng)暴中是否發(fā)揮重要作用、以及發(fā)揮何種作用還少見報(bào)道。
　　為了研究DC在豬鏈球菌感染導(dǎo)致炎癥風(fēng)暴中的作用，本研究首先建立體外培養(yǎng)豬外周血單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞(Monocyte-derived DCs，MoDCs)的方法，依據(jù)樹突狀細(xì)胞共同特點(diǎn)，對目標(biāo)細(xì)胞的形態(tài)、細(xì)胞膜表面標(biāo)志、吞噬能力、刺激

4、T淋巴細(xì)胞增殖能力進(jìn)行檢測，結(jié)果得到高質(zhì)量的MoDC，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。接下來用豬鏈球菌2型野生菌株SC19刺激MoDC，檢測MoDC分泌的細(xì)胞因子種類，重點(diǎn)考察促炎因子、抑炎因子、IL-12等的水平，為評價(jià)MoDC在炎癥反應(yīng)中的貢獻(xiàn)及定向誘導(dǎo)何種Th亞型細(xì)胞分化提供依據(jù)。最后，將MoDC和CD4+T細(xì)胞混合在一起，用SC19刺激細(xì)胞混合物，獲得CD4+T細(xì)胞定向分化的結(jié)果，為闡明MoDC在引發(fā)炎癥風(fēng)暴中的作用提供進(jìn)一步的依據(jù)，主要

5、研究內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　(1)成功建立了體外培養(yǎng)豬外周血MoDC的方法。采集豬前腔靜脈的外周血，通過Ficoll-Hypaque密度梯度離心法，先分離到豬的外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheralblood mononuclear cells，PBMCs)，再通過免疫磁珠分選法分離到高純度的CD14+的單核細(xì)胞，將CD14+的單核細(xì)胞用含有豬GM-CSF和豬IL-4的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，并進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)顯微鏡觀察、細(xì)胞膜表

6、面標(biāo)志流式檢測、吞噬中性紅能力檢測、刺激T淋巴細(xì)胞增殖能力的檢測，結(jié)果表明通過3～5d后得到大量高純度半懸浮的豬MoDC。
　　(2)用SC19刺激培養(yǎng)至5d的MoDC，細(xì)胞流式表型分析顯示MoDC的CD1和CD172a表達(dá)下降，吞噬中性紅的能力降低，刺激T淋巴細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，表明SC19可以刺激MoDC的成熟，且MoDC存在自發(fā)成熟的現(xiàn)象。受SC19刺激后，MoDC分泌高水平IL-1β、IL-8、TNF-α、IFN-γ等促炎性

7、細(xì)胞因子，分泌低水平IL-10、TGF-β抑炎性細(xì)胞因子，分泌很高水平的IL-12，其中IL-8和IL-12的分泌水平呈現(xiàn)明顯的SC19劑量依賴性。MoDC分泌高水平IL-12的結(jié)果提示SC19刺激MoDC后會(huì)誘導(dǎo)CD4+T向Th1亞型分化。
　　(3)為進(jìn)一步驗(yàn)證SC19刺激MoDC確實(shí)會(huì)誘導(dǎo)CD4+T向Th1亞型分化，將培養(yǎng)5d的MoDC與新分離的CD4+T細(xì)胞混合，加入SC19刺激，17h后流式檢測Th亞型，結(jié)果顯示Th1亞