豬鏈球菌粘附素蛋白Fhb與受體Gb2復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)解析.pdf

1、豬鏈球菌是一種新發(fā)的人獸共患病病原，可以引起豬腦膜炎、膿毒癥，也能引起人腦膜炎和中毒休克樣綜合征。豬鏈球菌是引起成人鏈球菌腦膜炎的第二大病因，僅次于肺炎鏈球菌。在已鑒定的35種血清型中，豬鏈球菌血清2型是最主要的致病菌株。但是，豬鏈球菌血清2型引起腦膜炎的分子機(jī)理還不清楚。
　　細(xì)菌粘附素分子和宿主細(xì)胞表面受體介導(dǎo)的細(xì)菌粘附在豬鏈球菌腦膜炎中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。研究表明豬鏈球菌粘附素Fhb可以與宿主細(xì)胞表面的糖脂分子GbO3結(jié)合。我們

2、課題組發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)hb是引起豬鏈球菌腦膜炎的重要毒力因子。Fhb能激活TGF-β信號(hào)通路，下調(diào)claudin-5的表達(dá)，增強(qiáng)血腦屏障的通透性，促使豬鏈球菌穿過(guò)血腦屏障。我們實(shí)驗(yàn)室證實(shí)GbO3參與Fhb介導(dǎo)的豬鏈球菌與人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附和穿血腦屏障過(guò)程。但是Fhb如何特異性的識(shí)別受體GbO3的結(jié)構(gòu)機(jī)理尚不清楚。
　　此外，F(xiàn)hb在豬鏈球菌血中存活和逃避補(bǔ)體介導(dǎo)的宿主天然免疫中發(fā)揮著重要作用。Fhb通過(guò)招募人補(bǔ)體調(diào)節(jié)因子factor

3、H，協(xié)助factor I降解沉積在豬鏈球菌表面的補(bǔ)體成分C3b，從而抑制補(bǔ)體介導(dǎo)的調(diào)理吞噬作用。Fhb還能與補(bǔ)體成分C3b和C3d直接結(jié)合。但是，F(xiàn)hb結(jié)合多種血清成分的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)還不清楚。本研究運(yùn)用結(jié)構(gòu)生物學(xué)手段解析了Fhb以及Fhb與受體Gb2復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，解釋了Fhb識(shí)別受體Gb3的結(jié)構(gòu)機(jī)理，并發(fā)現(xiàn)了Fhb與多種血清成分結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
　　本文第一部分是Fhb蛋白的表達(dá)純化以及結(jié)晶篩選和優(yōu)化。生物信息學(xué)分析表明Fhb由二級(jí)結(jié)

4、構(gòu)豐富的N端和無(wú)規(guī)卷曲組成的C端組成。先前的研究表明Fhb與受體相互作用的區(qū)域?yàn)镹端。因此，我們表達(dá)了45-344aa的片段N-Fhb，并利用Ni2+柱和分子篩純化了N-Fhb，然后利用晶體篩選工具盒進(jìn)行了結(jié)晶篩選和優(yōu)化，獲得了一套分辨率2.33的數(shù)據(jù)。純化和結(jié)晶的過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)N-Fhb存在降解。蛋白印跡和蛋白N端測(cè)序顯示N-Fhb降解的位點(diǎn)是K139。因此，我們又表達(dá)了Fhb從139-343aa的片段Fhb RBD，然后進(jìn)行了純化

5、、結(jié)晶篩選和優(yōu)化，獲得一套分辨率1.65的衍射數(shù)據(jù)。由于Fhb RBD沒(méi)有同源結(jié)構(gòu)，無(wú)法通過(guò)MR法來(lái)解析結(jié)構(gòu)。我們利用大腸桿菌B834菌株表達(dá)了Fhb RBD硒代蛋白，然后純化和結(jié)晶硒帶蛋白，最終收集到了一套分辨率1.5的衍射數(shù)據(jù)。
　　本文第二部分是 Fhb和Fhb與 Gb2復(fù)合物的結(jié)構(gòu)解析。利用 SAD法解析N-Fhb結(jié)構(gòu)時(shí)，發(fā)現(xiàn)反常散射信號(hào)太弱，無(wú)法解析結(jié)構(gòu)。通過(guò)用B834菌株表達(dá)Fhb RBD，提高Se原子替代率，增強(qiáng)反常

6、散射信號(hào)和提高信噪比，最終采用SAD法解析了Fhb RBD的結(jié)構(gòu)。以Fhb RBD的結(jié)構(gòu)為模型，采用 MR法解析了Fhb RBD與Gb2復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。
　　本文第三部分分析了Fhb RBD和Fhb RBD與Gb2復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，闡明Fhb識(shí)別Gb2的結(jié)構(gòu)機(jī)理，解釋 Fhb招募多種血清成分的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。Fhb RBD是由一個(gè)典型的β三明治核心和外側(cè)的3個(gè)α螺旋組成。受體Gb2結(jié)合在Fhb表面一個(gè)凹陷的口袋中。Fhb與Gb2結(jié)合主要由氫鍵

7、和疏水作用介導(dǎo)。對(duì)于α-Gal， Y198與6-OH形成氫鍵，Q255與6-OH和O-5形成氫鍵，R238與4-OH，N285和G233與3-OH形成氫鍵。對(duì)于β-Gal，K316與2-OH和3-OH形成氫鍵，E327與2-OH形成氫鍵。Y198，F(xiàn)283，F(xiàn)318與α-Gal的非極性面形成疏水接觸作用， W258與β-Gal的非極性面形成疏水作用。ITC測(cè)定了與受體結(jié)合相關(guān)氨基酸突變體與Gb2的親和力，突變體蛋白與Gb2的結(jié)合能力顯著

8、下降。Fhb的天然受體是Gb3和Gb4，但Fhb對(duì)兩者結(jié)合能力差別很大。通過(guò)結(jié)構(gòu)模擬，我們解釋了Fhb對(duì)Gb3和Gb4結(jié)合能力的差異。氨基酸組成分析表明N-Fhb富含帶電的氨基酸，尤其是帶負(fù)電的氨基酸。表面電荷分布分析也表明，F(xiàn)hb RBD表面有大片的負(fù)電荷集中區(qū)和正電荷集中區(qū)。不同factor H結(jié)合蛋白序列和結(jié)構(gòu)同源度都很低。但是已解析結(jié)構(gòu)的3個(gè)factor H結(jié)合蛋白表面都有比較大面積的負(fù)電荷集中區(qū)，而且已被證實(shí)主要通過(guò)表面帶負(fù)電

9、的氨基酸與factor H結(jié)合。我們推測(cè)Fhb也是通過(guò)表面負(fù)電荷集中區(qū)與factor H結(jié)合。目前已經(jīng)解析結(jié)構(gòu)的多種金黃色葡萄球菌C3d結(jié)合蛋白表面都有大面積的正電荷集中區(qū)，而C3d表面有大面積的負(fù)電荷集中區(qū)，兩者通過(guò)電荷互作結(jié)合。我們推測(cè) Fhb也通過(guò)電荷互作與C3d結(jié)合。C3d是C3b的一個(gè)降解片段，F(xiàn)hb應(yīng)該通過(guò)電荷互作與C3b結(jié)合。
　　本文第四部分解析了另外一個(gè)功能未知的豬鏈球菌毒力因子1083蛋白的結(jié)構(gòu)。通過(guò)序列和結(jié)構(gòu)