TRX與STAT-3在肝細胞肝癌高表達及相互作用研究.pdf

1、背景:據統(tǒng)計,全世界每年新發(fā)肝癌26萬例,其中42.5﹪在中國,中國肝癌死亡率為20.4/10萬,在原發(fā)性肝癌中肝細胞肝癌約占91.5﹪,因此加強對肝細胞肝癌的發(fā)生發(fā)展因素的研究將會對肝癌的預防,診斷及治療等方面具有更加普遍的意義.我們已知肝細胞肝癌的發(fā)生發(fā)展是多基因突變、多階段的演進過程,但我們卻很難確定在這一過程中每一個已突變的基因或未突變而可能突變基因的作用及與或對另外某一或某些基因在肝細胞肝癌發(fā)生發(fā)展中的可能的作用機制及功能,雖

2、然目前在這個方面的研究已經展開但卻不夠深入,只有通過對這些在肝細胞肝癌發(fā)生發(fā)展中起著重要作用的基因之間的聯(lián)系的深入研究才能使我們對肝細胞肝癌的發(fā)生發(fā)展有著更加深入的認識,對肝細胞肝癌診斷及治療等具有重大的指導作用. 硫氧還蛋白(Thioredoxin,TRX)是一種小分子含硒蛋白質,分子量約為12kD.其廣泛存在于原核、真核生物中,它與硫氧還蛋白還原酶(TRXR)、還原型煙酰腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)三者共同組成硫氧還蛋白系

3、統(tǒng)而發(fā)揮作用.信號轉導和轉錄激活因子(signal transducers and activators 0f transcription,STATs)是研究干擾素誘導基因轉錄時首次鑒定的一個胞漿蛋白家族.兩者共同參與了某一或某些細胞狀態(tài)的調節(jié),由此我們推測這種可能的相互作用機制也可能存在于肝細胞肝癌中而且發(fā)揮著某些功能,而這些功能將對肝細胞肝癌發(fā)生發(fā)展產生不容忽視的影響,如果我們能夠闡明兩者之間的相互作用機制及功能將會為臨床開展對肝細

4、胞肝癌發(fā)生和發(fā)展的認識及診斷和治療等產生重大的指導作用. 方法： 1 收集浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院外科手術切除的肝細胞肝癌的標本30例,所有標本均取自首次切除肝細胞肝癌的患者,術前均未接受放療或化療.所有標本均在腫瘤切除后30 min內采集,同時取包括癌組織及距癌灶5cm以上的癌旁組織,距癌組織邊緣10cm處的正常組織包括部分硬化組織,所取組織迅速凍存于液氮并保存在-80℃,以便提取mRNA及蛋白,以上所有標本均經臨床

5、和病理診斷證實,具有完整的病例資料,標本保存于外科實驗室. 2 逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測mRNA的表達取約50mg組織應用TRIzol法常規(guī)提取總RNA,經紫外微量分光光度儀定量后,取2μg總RNA,隨機引物法逆轉錄合成cDNA.以β-actin作為內參照,進行半定量聚合酶鏈反應(PCR)擴增.結合臨床資料按因素進行實驗分組并分別進行實驗,嚴格控制實驗誤差在有效范圍內.TRX引物(擴增產物為383bp)上游5＇-A

6、AGCCTTGGACGCTGCAGGt-3＇,下游5＇-GTCACGCAGATGGCAACTGG-3＇;STAT-3引物(擴增產物為226bp)上游:5＇-AACTCTTGGGACCTGGTGTG-3＇,下游5＇-AAGGTGCCTGGAGGCTTAGT-3＇;β-actin引物(擴增產物為524bp)上游:5＇-TAGAAGCAGTFGCGGTGG-3＇,下游5＇-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3＇.PCR擴增條件為:95℃預

7、變性4 min,33個循環(huán){95℃45 s-(TRX 57℃,45 s),(STAT-3 64.5℃,45 s),(β-actin57℃,45 s)-72℃,45s},72℃充分延伸10min,取擴增產物5μl,在溴化乙錠染色、1.5﹪瓊脂糖凝膠下100 V電泳45 min,以Kodak DNA Analysis 2.0凝膠圖像分析系統(tǒng)處理,讀取目的條帶和內參的光密度值,結果以比值(樣本光吸收度A值/內參照光吸收度A值)表示.

8、3 Western blotting檢測蛋白表達水平取約50mg組織研磨后,加入1ml預冷組織裂解液(10mM Tris-HCl,0.25mMSucroce,5mM EDTA,50mM NaCl,30mM焦磷酸鈉, 50mM NaF,1mMNa3VO4,2﹪CocKtail),冰上靜置1小時,4℃低溫12000轉離心30分鐘,取上清液,Bio-Rad蛋白測定試劑盒(BCA)測定蛋白濃度.取4μg蛋白樣品加4×上樣緩沖液,100℃煮4分鐘

9、變性后,結合臨床資料按因素進行實驗分組并分別進行實驗,嚴格控制實驗誤差在有效范圍內.行12﹪聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白質,電轉移法將蛋白質轉移到PVDF膜,用含5﹪脫脂牛奶的TBS封閉1小時,加入一抗(1:1000稀釋),搖床上反應1小時后4℃冰箱中過夜,TB3ST液洗膜5分鐘×3,加入二抗中(1:2000稀釋),反應2小時,TBST洗膜5分鐘×3次后作ECL,化學發(fā)光,X片(Kodak)曝光顯影.Kodak DNA

10、 Analysis 2.0凝膠圖像分析系統(tǒng)測定目的顯影條帶和內參照β-actin的光吸收度A值,結果以比值(樣本光吸收度A值/內參照光吸收度A值)表示. 4統(tǒng)計學分析 實驗結果采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析.定量資料采用X±s表示,兩組比較用f檢驗;多組比較用方差分析,偏態(tài)分布用非參數檢驗,指標之間用Spearman等級相關分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義. 結果： 1.肝細胞肝癌、癌旁及正常肝組織

11、中TRX和STAT-3的表達:30例標本mRNA及蛋白均有不同程度表達,TRX和STAT-3在肝癌組織中為高表達在癌旁及正常組織為低表達并呈遞減趨勢,其差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05). 2.TRX和STAT-3的表達與肝細胞肝癌臨床病理特征關系:二者mRNA及蛋白表達隨著肝細胞肝癌組織分化程度降低而有增高的趨勢,其差異具有統(tǒng)計學意浙江人學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院SL(P<0.05),而與腫瘤大小,個數,瘤栓,血管侵犯,微轉移灶及復

12、發(fā)轉移無顯著相關. 3 TRx和STAT-3表達失衡相關性研究:TRx和STAT-3表達為正相關mRNA結果為(r=0.380,P=0.038)蛋白結果為(r=0.468,P=0.009). 結論 1.TRX和STAT-3在肝細胞肝癌中較之癌旁及正常組織高表達,及正常組織表達呈遞減趨勢. 2.TRX和STAT-3在不同分化的肝細胞肝癌組織表達具有差異,肝癌發(fā)生發(fā)展有關.二者在癌,癌旁提示其與肝細胞.