TRX與STAT-3在肝細(xì)胞肝癌高表達(dá)及相互作用研究.pdf

1、背景:據(jù)統(tǒng)計(jì),全世界每年新發(fā)肝癌26萬例,其中42.5﹪在中國,中國肝癌死亡率為20.4/10萬,在原發(fā)性肝癌中肝細(xì)胞肝癌約占91.5﹪,因此加強(qiáng)對肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生發(fā)展因素的研究將會(huì)對肝癌的預(yù)防,診斷及治療等方面具有更加普遍的意義.我們已知肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生發(fā)展是多基因突變、多階段的演進(jìn)過程,但我們卻很難確定在這一過程中每一個(gè)已突變的基因或未突變而可能突變基因的作用及與或?qū)α硗饽骋换蚰承┗蛟诟渭?xì)胞肝癌發(fā)生發(fā)展中的可能的作用機(jī)制及功能,雖

2、然目前在這個(gè)方面的研究已經(jīng)展開但卻不夠深入,只有通過對這些在肝細(xì)胞肝癌發(fā)生發(fā)展中起著重要作用的基因之間的聯(lián)系的深入研究才能使我們對肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生發(fā)展有著更加深入的認(rèn)識(shí),對肝細(xì)胞肝癌診斷及治療等具有重大的指導(dǎo)作用. 硫氧還蛋白(Thioredoxin,TRX)是一種小分子含硒蛋白質(zhì),分子量約為12kD.其廣泛存在于原核、真核生物中,它與硫氧還蛋白還原酶(TRXR)、還原型煙酰腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)三者共同組成硫氧還蛋白系

3、統(tǒng)而發(fā)揮作用.信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducers and activators 0f transcription,STATs)是研究干擾素誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄時(shí)首次鑒定的一個(gè)胞漿蛋白家族.兩者共同參與了某一或某些細(xì)胞狀態(tài)的調(diào)節(jié),由此我們推測這種可能的相互作用機(jī)制也可能存在于肝細(xì)胞肝癌中而且發(fā)揮著某些功能,而這些功能將對肝細(xì)胞肝癌發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生不容忽視的影響,如果我們能夠闡明兩者之間的相互作用機(jī)制及功能將會(huì)為臨床開展對肝細(xì)

4、胞肝癌發(fā)生和發(fā)展的認(rèn)識(shí)及診斷和治療等產(chǎn)生重大的指導(dǎo)作用. 方法： 1 收集浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院外科手術(shù)切除的肝細(xì)胞肝癌的標(biāo)本30例,所有標(biāo)本均取自首次切除肝細(xì)胞肝癌的患者,術(shù)前均未接受放療或化療.所有標(biāo)本均在腫瘤切除后30 min內(nèi)采集,同時(shí)取包括癌組織及距癌灶5cm以上的癌旁組織,距癌組織邊緣10cm處的正常組織包括部分硬化組織,所取組織迅速凍存于液氮并保存在-80℃,以便提取mRNA及蛋白,以上所有標(biāo)本均經(jīng)臨床

5、和病理診斷證實(shí),具有完整的病例資料,標(biāo)本保存于外科實(shí)驗(yàn)室. 2 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測mRNA的表達(dá)取約50mg組織應(yīng)用TRIzol法常規(guī)提取總RNA,經(jīng)紫外微量分光光度儀定量后,取2μg總RNA,隨機(jī)引物法逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA.以β-actin作為內(nèi)參照,進(jìn)行半定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增.結(jié)合臨床資料按因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組并分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn),嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)誤差在有效范圍內(nèi).TRX引物(擴(kuò)增產(chǎn)物為383bp)上游5＇-A

6、AGCCTTGGACGCTGCAGGt-3＇,下游5＇-GTCACGCAGATGGCAACTGG-3＇;STAT-3引物(擴(kuò)增產(chǎn)物為226bp)上游:5＇-AACTCTTGGGACCTGGTGTG-3＇,下游5＇-AAGGTGCCTGGAGGCTTAGT-3＇;β-actin引物(擴(kuò)增產(chǎn)物為524bp)上游:5＇-TAGAAGCAGTFGCGGTGG-3＇,下游5＇-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3＇.PCR擴(kuò)增條件為:95℃預(yù)

7、變性4 min,33個(gè)循環(huán){95℃45 s-(TRX 57℃,45 s),(STAT-3 64.5℃,45 s),(β-actin57℃,45 s)-72℃,45s},72℃充分延伸10min,取擴(kuò)增產(chǎn)物5μl,在溴化乙錠染色、1.5﹪瓊脂糖凝膠下100 V電泳45 min,以Kodak DNA Analysis 2.0凝膠圖像分析系統(tǒng)處理,讀取目的條帶和內(nèi)參的光密度值,結(jié)果以比值(樣本光吸收度A值/內(nèi)參照光吸收度A值)表示.

8、3 Western blotting檢測蛋白表達(dá)水平取約50mg組織研磨后,加入1ml預(yù)冷組織裂解液(10mM Tris-HCl,0.25mMSucroce,5mM EDTA,50mM NaCl,30mM焦磷酸鈉, 50mM NaF,1mMNa3VO4,2﹪CocKtail),冰上靜置1小時(shí),4℃低溫12000轉(zhuǎn)離心30分鐘,取上清液,Bio-Rad蛋白測定試劑盒(BCA)測定蛋白濃度.取4μg蛋白樣品加4×上樣緩沖液,100℃煮4分鐘

9、變性后,結(jié)合臨床資料按因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組并分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn),嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)誤差在有效范圍內(nèi).行12﹪聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白質(zhì),電轉(zhuǎn)移法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜,用含5﹪脫脂牛奶的TBS封閉1小時(shí),加入一抗(1:1000稀釋),搖床上反應(yīng)1小時(shí)后4℃冰箱中過夜,TB3ST液洗膜5分鐘×3,加入二抗中(1:2000稀釋),反應(yīng)2小時(shí),TBST洗膜5分鐘×3次后作ECL,化學(xué)發(fā)光,X片(Kodak)曝光顯影.Kodak DNA

10、 Analysis 2.0凝膠圖像分析系統(tǒng)測定目的顯影條帶和內(nèi)參照β-actin的光吸收度A值,結(jié)果以比值(樣本光吸收度A值/內(nèi)參照光吸收度A值)表示. 4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析.定量資料采用X±s表示,兩組比較用f檢驗(yàn);多組比較用方差分析,偏態(tài)分布用非參數(shù)檢驗(yàn),指標(biāo)之間用Spearman等級相關(guān)分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義. 結(jié)果： 1.肝細(xì)胞肝癌、癌旁及正常肝組織

11、中TRX和STAT-3的表達(dá):30例標(biāo)本mRNA及蛋白均有不同程度表達(dá),TRX和STAT-3在肝癌組織中為高表達(dá)在癌旁及正常組織為低表達(dá)并呈遞減趨勢,其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05). 2.TRX和STAT-3的表達(dá)與肝細(xì)胞肝癌臨床病理特征關(guān)系:二者mRNA及蛋白表達(dá)隨著肝細(xì)胞肝癌組織分化程度降低而有增高的趨勢,其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意浙江人學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院SL(P<0.05),而與腫瘤大小,個(gè)數(shù),瘤栓,血管侵犯,微轉(zhuǎn)移灶及復(fù)

12、發(fā)轉(zhuǎn)移無顯著相關(guān). 3 TRx和STAT-3表達(dá)失衡相關(guān)性研究:TRx和STAT-3表達(dá)為正相關(guān)mRNA結(jié)果為(r=0.380,P=0.038)蛋白結(jié)果為(r=0.468,P=0.009). 結(jié)論 1.TRX和STAT-3在肝細(xì)胞肝癌中較之癌旁及正常組織高表達(dá),及正常組織表達(dá)呈遞減趨勢. 2.TRX和STAT-3在不同分化的肝細(xì)胞肝癌組織表達(dá)具有差異,肝癌發(fā)生發(fā)展有關(guān).二者在癌,癌旁提示其與肝細(xì)胞.