STAT3活化對(duì)B細(xì)胞淋巴瘤與巨噬細(xì)胞間相互作用影響的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：
　　 浸潤(rùn)到腫瘤組織中的巨噬細(xì)胞被稱(chēng)為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associatedmacrophages，TAMs)，因其在腫瘤微環(huán)境中的重要作用而受到廣泛關(guān)注。最近研究顯示，TAMs特別是M2型巨噬細(xì)胞參與到多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，這其中包括血液學(xué)的惡性腫瘤，如霍奇金淋巴瘤、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、免疫母T細(xì)胞淋巴瘤等，在這些腫瘤中CD163抗體標(biāo)識(shí)陽(yáng)性的M2型巨噬細(xì)胞高表達(dá)預(yù)示著預(yù)后不良。
　　

2、 信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signaltransducersandactivatorsoftranscription3，Stat3)是一種與腫瘤的血管生成、免疫抑制、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞增殖等密切相關(guān)的信號(hào)因子，在多種惡性腫瘤中，腫瘤細(xì)胞Stat3的活化與患者的低生存率密切相關(guān)。我們?cè)谙惹暗难芯恐幸惨呀?jīng)證明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、腎細(xì)胞瘤、卵巢癌以及神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞與M2型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，Stat3信號(hào)傳導(dǎo)通路會(huì)明顯活化，但是細(xì)胞間相互作用

3、的分子機(jī)制并沒(méi)有得到詳細(xì)闡述。
　　 BrdU是一種DNA前體胸腺嘧啶核苷類(lèi)似物，能夠競(jìng)爭(zhēng)性摻入DNA合成期細(xì)胞單鏈DNA核苷酸序列替代胸腺嘧啶。由于組織細(xì)胞內(nèi)無(wú)內(nèi)源性BrdU存在，故可通過(guò)測(cè)定細(xì)胞中BrdU摻入水平來(lái)間接反映細(xì)胞增殖的狀況。
　　 目的:
　　 探討在體外共培養(yǎng)試驗(yàn)中，Stat3活化對(duì)B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞與巨噬細(xì)胞間相互作用的意義。
　　 方法:
　　 1.體外共培養(yǎng)對(duì)淋巴瘤細(xì)胞增殖

4、的影響
　　 外周血由來(lái)的單核細(xì)胞來(lái)自于2名健康志愿者，免疫磁珠法收集CD14陽(yáng)性單核細(xì)胞。GM-CSF加入單核細(xì)胞培養(yǎng)基中刺激5天誘導(dǎo)其分化成未成熟的巨噬細(xì)胞，再加入IFN-γ刺激24h誘導(dǎo)未成熟的巨噬細(xì)胞分化成成熟的M1型巨噬細(xì)胞;GM-CSF和M-CSF共同加入單核細(xì)胞培養(yǎng)基中刺激5天誘導(dǎo)其分化成未成熟的M2型巨噬細(xì)胞，再加入IL-10刺激24h誘導(dǎo)未成熟的M2型巨噬細(xì)胞分化成成熟的M2型巨噬細(xì)胞。淋巴瘤細(xì)胞系與巨噬細(xì)胞在

5、含有2％FBS/D-MEM的24孔培養(yǎng)皿中直接共培養(yǎng)，間接共培養(yǎng)是用一個(gè)多聚碳酸膜將巨噬細(xì)胞與淋巴瘤細(xì)胞分開(kāi)，共培養(yǎng)3天后，BrdU摻入并行雙重免疫染色評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞的增殖狀況。簡(jiǎn)略說(shuō)明雙重免疫染色的過(guò)程:加入BrdU孵育3h后，細(xì)胞涂片離心機(jī)將細(xì)胞收集到載玻片上并用丙酮固定，CD204作為全部巨噬細(xì)胞的標(biāo)識(shí)物進(jìn)行免疫染色并行DAB顯色，甘氨酸緩沖液(PH2.2)沖洗殘余抗體，抗BrdU抗體染色并用HistiGreen溶液顯色。
　

6、　 2.Stat3活化對(duì)淋巴瘤細(xì)胞增殖的影響
　　 siRNA干擾沉默淋巴瘤細(xì)胞Stat3，Westernblot檢測(cè)SLVL細(xì)胞中Stat3蛋白的表達(dá)水平。共培養(yǎng)3天后，BrdU摻入并行雙重免疫染色評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞的增殖狀況。
　　 3.C5a對(duì)淋巴瘤細(xì)胞與巨噬細(xì)胞間相互作用的影響
　　 應(yīng)用細(xì)胞因子分析分別檢測(cè)單培養(yǎng)和共培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)液中存在的的可溶性細(xì)胞因子，RT-PCR檢測(cè)C5a受體的表達(dá)。SLVL細(xì)胞在C5a

7、刺激下培養(yǎng)24h，然后BrdU摻入并行免疫染色評(píng)價(jià)其對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響，行Westernblot檢測(cè)SLVL細(xì)胞中pStat3蛋白的表達(dá)水平。SLVL細(xì)胞與M2型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的培養(yǎng)液中加入C5a受體阻斷劑，共同孵育24h，BrdU摻入并行免疫染色評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞的增殖狀況。
　　 結(jié)果:
　　 1.與M2型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后，淋巴瘤細(xì)胞增殖活性顯著增強(qiáng)
　　 B細(xì)胞淋巴瘤系SLVL細(xì)胞分別與imM(未成熟的)、M1

8、及M2型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)三天，BrdU摻入后行雙重免疫染色評(píng)價(jià)淋巴瘤細(xì)胞的細(xì)胞增殖情況，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與M2型巨噬細(xì)胞直接共培養(yǎng)的SLVL細(xì)胞中，更多摻入了BrdU。測(cè)量SLVL細(xì)胞核的最大直徑發(fā)現(xiàn)，單培養(yǎng)的SLVL細(xì)胞為15.7±2.8μm，與M2型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的SLVL細(xì)胞為18.8±2.7μm(P=0.003，n=20)。相比單培養(yǎng)以及imM、M1型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，與M2型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的的SLVL細(xì)胞中更多的摻入了BrdU;在另

9、外兩種B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞（Raji，Daudi）的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，也得到了相似的結(jié)果。另外，我們嘗試用一個(gè)跨膜培養(yǎng)系統(tǒng)將巨噬細(xì)胞與SLVL細(xì)胞分開(kāi)進(jìn)行間接共培養(yǎng)，相比之下，直接共培養(yǎng)的SLVL細(xì)胞中BrdU摻入更加明顯。
　　 2.巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)淋巴瘤細(xì)胞增殖依賴(lài)于Stat3的活化
　　 為了檢測(cè)Stat3活化在淋巴瘤細(xì)胞與巨噬細(xì)胞間相互作用中的意義，共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)前用siRNA沉默SLVL細(xì)胞Stat3基因，結(jié)果顯示，Stat3

10、蛋白的下調(diào)明顯抑制了SLVL細(xì)胞中BrdU的摻入。
　　 3.C5a參與了M2型巨噬細(xì)胞與淋巴瘤細(xì)胞間的相互作用
　　 對(duì)M1、M2、SLVL以及共培養(yǎng)的培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞因子分析，結(jié)果在M2的上清中發(fā)現(xiàn)了大量C5a。巧合的是SLVL細(xì)胞表達(dá)C5a的受體，在SLVL細(xì)胞中加入C5a進(jìn)行培養(yǎng)，行Westernblot測(cè)定其pStat3的表達(dá)，結(jié)果顯示pStat3蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng);經(jīng)C5a刺激后更多的SLVL細(xì)胞中摻入了BrdU

11、;而已經(jīng)用siRNA沉默Stat3基因的SLVL細(xì)胞經(jīng)C5a刺激后，其BrdU摻入并無(wú)明顯變化。最后，在SLVL與M2型巨噬細(xì)胞細(xì)胞的共培養(yǎng)液中加入C5a受體拮抗劑，發(fā)現(xiàn)摻入BrdU的SLVL細(xì)胞數(shù)略微減少，但是這種變化并不十分明顯。
　　 結(jié)論:
　　 1.B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞與M2型巨噬細(xì)胞相互作用導(dǎo)致Stat3活化是腫瘤進(jìn)展過(guò)程中非常重要的步驟，能夠使M2型巨噬細(xì)胞失活的Stat3抑制劑或者化合物可能會(huì)成為一種對(duì)B細(xì)胞