硫氧還蛋白相互作用蛋白在增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：糖尿病性視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy, DR）現(xiàn)在已成為全世界成年人人群中的主要致盲眼病，其發(fā)病率逐年增加。以視網(wǎng)膜異常新生血管為特征的增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變（proliferative diabetic retinopathy，PDR）是導(dǎo)致糖尿病性視網(wǎng)膜病變患者視力喪失的主要原因之一。約1/3的糖尿病患者最終會發(fā)展為PDR期。
　　目前有眾多臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明，高血糖在PDR的發(fā)生和發(fā)展中起到了關(guān)

2、鍵作用。高血糖可以引起視網(wǎng)膜內(nèi)多種損傷，如蛋白激酶C、多元醇途徑、己糖胺生物合成途徑的異常激活，以及過度產(chǎn)生糖基化終末產(chǎn)物等，這些高血糖誘導(dǎo)的損傷還可以導(dǎo)致過度的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而進(jìn)一步損害視網(wǎng)膜組織。同時，目前也有研究表明高血糖本身就具有促進(jìn)視網(wǎng)膜異常新生血管的功能。
　　目前研究認(rèn)為，玻璃體內(nèi)血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）含量增高是PDR視網(wǎng)膜新生血管形成的關(guān)

3、鍵。VEGF可誘導(dǎo)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、血管管腔形成并導(dǎo)致異常新生血管的產(chǎn)生。異常的新生血管會引起玻璃體積血、牽拉性視網(wǎng)膜脫離、新生血管性青光眼等并發(fā)癥，最終造成患者視力損害。目前有多種抗VEGF類藥物應(yīng)用于治療DR，這些藥物包括：貝伐單抗、雷珠單抗、阿柏西普、康柏西普等。然而長期眼內(nèi)注射抗VEGF藥物會增加眼部并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)，并且目前有研究表明在糖尿病患者人群中，長期眼內(nèi)注射抗VEGF藥物造成的全身并發(fā)癥較其它人群明顯增高，這些

4、全身并發(fā)癥包括高血壓、血栓形成以及傷口延遲愈合等。這是因?yàn)樘悄虿』颊咴谘蹆?nèi)VEGF含量及新生血管活動增多的同時，體內(nèi)其它組織如心臟和足等組織VEGF含量和新生血管活動降低。因此進(jìn)一步研究DR引起新生血管的機(jī)制以及開發(fā)新的藥物靶點(diǎn)是當(dāng)務(wù)之急。
　　哺乳動物體內(nèi)細(xì)胞的氧化還原主要由谷胱甘肽（glutathione（GSH））和硫氧還蛋白（thioredoxin，TRX）這兩個系統(tǒng)來調(diào)控。硫氧還蛋白相互作用蛋白（Thioredoxin-

5、interacting protein，TXNIP）又稱維生素D3上調(diào)蛋白1（vitamin D3-upregulated protein1，VDUP-1）是TRX系統(tǒng)中的內(nèi)源性抑制蛋白。已有研究表明高糖刺激能引起多種視網(wǎng)膜細(xì)胞尤其是視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)TXNIP，而高表達(dá)的TXNIP在調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜的炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激方面有重要的作用。同時，最新的研究表明，TXNIP與血管內(nèi)皮細(xì)胞新生血管活動有著緊密聯(lián)系，TXNIP通過與Rab5形成

6、復(fù)合物，參與到VEGF-VEGFR2信號通路及其下游的PLC-γ通路，從而調(diào)節(jié)VEGF介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞新生血管功能。也有研究顯示TXNIP基因敲除小鼠的VEGFR2/Akt通路功能及新生血管功能受損，當(dāng)過表達(dá)TXNIP后其新生血管能力得到了恢復(fù)。然而TXNIP在PDR中所起到的作用目前尚無研究。
　　本研究目的在于闡明高糖引起的人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞（Human retinal microvascular endothelial c

7、ells， HRMECs）高表達(dá)TXNIP在高糖引起的細(xì)胞新生血管活動中所起到的作用及機(jī)制，以及敲除HRMECs的TXNIP基因?qū)τ诟咛羌癡EGF所引起的新生血管活動的影響。同時我們通過視網(wǎng)膜新生血管體外培養(yǎng)模型，研究TXNIP基因敲除對于小鼠視網(wǎng)膜新生血管能力的影響。為進(jìn)一步闡明TXNIP在PDR中所起到的作用及機(jī)制提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.高糖對HRMECs增殖、遷移、管腔形成的影響。
　　HRMECs在

8、37℃，5％CO2的條件下，以含有5％胎牛血清，1％內(nèi)皮細(xì)胞生長補(bǔ)充劑（ECGS），100U/ ml青霉素和100μg/ ml鏈霉素的ECM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。（1）CCK-8實(shí)驗(yàn)測定高糖對HRMECs增殖的影響：用正常濃度糖（Control，5.6mM），中度高糖（MHG，15mM）和高糖（HG，30mM）刺激 HRMECs細(xì)胞。孵育24小時后，向每個孔中加入10μl CCK-8，然后再孵育2小時。當(dāng)從紅色變?yōu)辄S色時，用分光光度計(jì)在450n

9、m波長下測定各組的光密度（OD）值。（2）細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)評估高糖對HRMECs遷移的影響：將HRMECs置于24孔板上并培養(yǎng)至90％細(xì)胞密度。在無血清培養(yǎng)基中孵育6小時后，用1ml黃色移液管尖端刮除單層細(xì)胞。隨后，用PBS洗滌細(xì)胞三次以去除浮游細(xì)胞，并給予不同的刺激。在0小時和18小時拍攝細(xì)胞圖像，分析平均細(xì)胞移動距離。（3）Transwell遷移實(shí)驗(yàn)測定高糖對HRMEC遷移的影響：在5％CO2培養(yǎng)箱中將HRMECs在各種不同條件下培養(yǎng)2

10、4小時。然后，將細(xì)胞以1×105個細(xì)胞/孔的密度接種在含有200μl無血清培養(yǎng)基的Transwell小室中。同時將600μl的不同糖濃度的培養(yǎng)基加入到Transwell小室下方孵育6小時。6小時后，將Transwell在4％多聚甲醛中固定并用結(jié)晶紫染色。用棉簽刮取 Transwell的上表面以除去未遷移的細(xì)胞。對 Transwell進(jìn)行拍照，通過隨機(jī)計(jì)數(shù)5個顯微鏡視野來確定遷移的細(xì)胞數(shù)。（4）Matrigel管腔形成實(shí)驗(yàn)測定高糖對HRM

11、ECs管腔形成的影響：將不同濃度糖培養(yǎng)基預(yù)處理的HRMECs（每孔5×104個細(xì)胞）接種在Matrigel的表面上，再培養(yǎng)6小時。培養(yǎng)結(jié)束時拍攝細(xì)胞圖像，并使用Image-Pro Plus6.0軟件評估每個視野的總管腔形成長度。（5）中度高糖對HRMECs VEGF分泌的影響：通過使用ELISA試劑盒評估來自不同組HRMECs細(xì)胞的上清液中的VEGF濃度。（7）中度高糖對HRMECs的Akt/mTOR通路影響：使用蛋白免疫印跡法檢測中度

12、高糖條件下HRMEC中Akt和mTOR的表達(dá)。
　　2.TXNIP在中度高糖促進(jìn)的HRMECs遷移和管腔形成中的作用（1）中度高糖對 HRMECs的TXNIP變化的影響：中度高糖刺激HRMECs，并在不同點(diǎn)收取細(xì)胞，通過蛋白免疫印跡法檢測細(xì)胞 TXNIP的變化。（2）中度高糖對HRMECs細(xì)胞內(nèi)ROS的影響：HRMECs細(xì)胞內(nèi)ROS水平的檢測采用2’,7’-DCFH-DA探針法，將HRMECs均勻接種于6孔板中，細(xì)胞匯合度達(dá)到80

13、%密度時更換無血清ECM培養(yǎng)基同步，6 h后按實(shí)驗(yàn)分組加入不同刺激物干預(yù)，后換成含2’,7’-DCFH-DA探針（終濃度為10μmol/L）的無血清ECM培養(yǎng)基，37 ℃下避光孵育30 min，PBS洗滌3遍，將未結(jié)合的2’,7’-DCFH-DA充分沖洗掉，流式細(xì)胞儀檢測熒光強(qiáng)度，用熒光強(qiáng)度反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)ROS含量。（3）檢測TXNIP對中度高糖誘導(dǎo)的HRMECs新生血管形成的影響：細(xì)胞隨機(jī)分為正常糖對照組（5.5 mmol/L gluco

14、se，Control）、中度高糖（15 mmol/L glucose，MHG）、載體對照組（Scr siRNA轉(zhuǎn)染，Scr siRNA）、中度高糖+載體對照組（Scr siRNA+15 mmol/L glucose，Scr siRNA+MHG）、TXNIP siRNA轉(zhuǎn)染組（TXNIP siRNA單純轉(zhuǎn)染，TXNIP siRNA）、中度高糖+TXNIP siRNA轉(zhuǎn)染組（TXNIP siRNA+15 mmol/L glucose，TXN

15、IP siRNA+MHG）、中度高糖+抗氧化劑NAC組（NAC+15 mmol/L glucose，NAC+MHG）。分組刺激后進(jìn)行細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，Transwell遷移實(shí)驗(yàn)，Matrigel管腔形成實(shí)驗(yàn)檢測 HRMECs新生血管形成情況。并用蛋白免疫印跡法檢測敲除TXNIP基因?qū)HG誘導(dǎo)的HRMECs的Akt/mTOR信號通路的影響。
　　3.TXNIP在VEGF促進(jìn)的HRMECs遷移和管腔形成中的作用。檢測TXNIP對重組人V

16、EGF165（20 ng/ml）誘導(dǎo)的HRMECs新生血管形成的影響：細(xì)胞隨機(jī)分為正常培養(yǎng)組（Control）、VEGF165刺激組（20 ng/ml VEGF165，VEGF）、載體對照組（Scr siRNA轉(zhuǎn)染，Scr siRNA）、VEGF165+載體對照組（Scr siRNA+20 ng/ml VEGF165， Scr siRNA+VEGF）、TXNIP siRNA轉(zhuǎn)染組（TXNIP siRNA單純轉(zhuǎn)染，TXNIP siRNA）

17、、VEGF165+TXNIP siRNA轉(zhuǎn)染組（TXNIP siRNA+20 ng/ml VEGF165，TXNIP siRNA+VEGF）、VEGF165+抗氧化劑NAC組（NAC+20 ng/ml VEGF165，NAC+VEGF）。相應(yīng)細(xì)胞分組進(jìn)行CCK-8實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)、Matrigel管腔形成實(shí)驗(yàn)檢測HRMECs的新生血管活動。Scr siRNA組和TXNIP siRNA組以VEGF165（20

18、ng/ml）刺激5min，15min，30min，45min，1h，2h，4h后以蛋白印跡實(shí)驗(yàn)方法對各組細(xì)胞的VEGFR2、Akt及mTOR蛋白進(jìn)行定量分析。
　　4 TXNIP基因敲除對小鼠視網(wǎng)膜新生血管的影響。本研究以6周齡C57BL/6J背景的野生型小鼠（Wild type，WT）及相同背景的TXNIP基因敲除小鼠（TXNIP?/?）為動物模型；TXNIP基因敲除鼠模型的構(gòu)建采用TALEN技術(shù)，用PCR實(shí)驗(yàn)檢測其子代的基因表

19、型。實(shí)驗(yàn)動物分為2組，野生型C57BL/6J小鼠組（WT）及TXNIP基因敲除小鼠組（TKO），每組小鼠各6只。小鼠處死后完整取出眼球，將其以無菌生理鹽水充分沖洗。手術(shù)顯微鏡下以15°側(cè)切刀沿角膜緣切開眼球，去除角膜、晶體和玻璃體，沿鞏膜完整剝離神經(jīng)視網(wǎng)膜組織，并去除視網(wǎng)膜粘附的脈絡(luò)膜組織及視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。將提取的視網(wǎng)膜組織環(huán)形剪除約0.2mm寬周邊視網(wǎng)膜組織，以視神經(jīng)為中心，用小梁剪剪為均勻的4塊視網(wǎng)膜組織。將視網(wǎng)膜組織放入預(yù)冷的

20、無血清ECM培養(yǎng)基中2小時。來源于同一眼球的視網(wǎng)膜組織塊分到不同的刺激組。將視網(wǎng)膜組織平鋪在提前凝固的Matrigel基質(zhì)膠上，神經(jīng)纖維層面朝上，并使視網(wǎng)膜的邊緣與基質(zhì)膠充分接觸。平鋪好視網(wǎng)膜組織后在其上再加入液態(tài)的1:1培養(yǎng)基比例的基質(zhì)膠300ml，室溫放置1h固定?；|(zhì)膠凝固后在每個孔內(nèi)放入不同刺激的培養(yǎng)基500ml，分別為：Control組（無刺激物培養(yǎng)基）；中度高糖組（15 mmol/L glucose， MHG）；VEGF組（

21、20ng/ml VEGF）；中度高糖+VEGF組（15 mmol/L glucose+20ng/ml VEGF，MHG+VEGF）。每2天換一次培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)第10天在倒置顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜新生血管長出情況并拍照。
　　結(jié)果：
　　1.中度高糖通過激活HRMECs的Akt/mTOR通路誘導(dǎo)遷移和管腔形成，但不引起HRMECs增殖。
　　1） HRMECs在不同濃度高糖培養(yǎng)24小時后，通過CCK-8實(shí)驗(yàn)方法檢測其吸光度。結(jié)

22、果表明無論是MHG組還是HG組細(xì)胞增殖較對照組無顯著性差異（P＞0.05）。
　　2）通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)方法研究不同濃度高糖對 HRMECs遷移能力的影響， MHG組與對照組相比有顯著性差異（P<0.01），而HG組與對照組相比無顯著性差異（P＞0.05）。
　　3）通過使用 Matrigel管腔形成實(shí)驗(yàn)的方法研究不同濃度高糖對于HRMECs管腔形成的影響。MHG組HRMECs管腔總長度較對照組有明

23、顯的增加（P＜0.05），HG組HRMECs管腔總長度較對照組無顯著性差異（P＞0.05）。
　　4）收集在MHG刺激下不同時間點(diǎn)的細(xì)胞培養(yǎng)基上清液，并用ELISA試劑盒分析其VEGF含量。結(jié)果表明，HRMECs本身自分泌的VEGF量極少，并且MHG并不影響HRMECs自分泌VEGF含量的變化（P＞0.05）。
　　5）通過蛋白印跡實(shí)驗(yàn)方法檢測Akt和mTOR的磷酸化變化，結(jié)果顯示，MHG組Akt及其下游通路mTOR的磷酸化

24、較對照組增加（P＜0.05）
　　2.敲除HRMECs細(xì)胞的TXNIP抑制MHG引起的Akt/mTOR信號通路激活，進(jìn)而降低MHG引起的遷移和管腔形成能力。
　　1）通過蛋白印跡實(shí)驗(yàn)方法檢測HRMECs在不同MHG刺激時間下的TXNIP變化。結(jié)果顯示TXNIP在2h、4h、6h表達(dá)升高（P＜0.05或P＜0.01）。
　　2）MHG刺激會短暫性的升高 ROS，分別在5 min，30min，45min的時間點(diǎn)與對照組有顯

25、著性差異（P＜0.05或P＜0.01）。而1h至24H其細(xì)胞內(nèi)ROS較正常無顯著性差異（P＞0.05）。
　　3）用TXNIP小干擾RNA（TXNIP siRNA）轉(zhuǎn)染HRMECs，并用載體對照組小干擾RNA（Scrambled siRNA，Scr siRNA）作對照組，研究TXNIP基因敲除對HRMECs細(xì)胞新生血管活動的影響。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell遷移實(shí)驗(yàn)及 Matrigel管腔形成實(shí)驗(yàn)表明，TXNIP siRNA組

26、在MHG刺激下的新生血管能力明顯下降（P<0.01）。
　　4）敲除TXNIP基因阻斷了MHG對于HRMECs的Akt/mTOR信號通路的激活（P<0.01）。
　　5）抗氧化劑 NAC也可以降低 MHG引起的遷移和管腔形成能力（P<0.01）。
　　3.敲除TXNIP基因阻礙VEGF誘導(dǎo)的VEGFR2信號通路激活，進(jìn)而降低VEGFR2引起的HRMECs新生血管活動。
　　1）HRMECs在VEGF下，其細(xì)胞增殖

27、能力、遷移能力、管腔形成能力明顯增加（P<0.01）。
　　2）敲除TXNIP基因后降低了VEGF誘導(dǎo)的HRMECs新生血管活動（P<0.01）。
　　3）敲除TXNIP基因降低了VEGF引起的HRMECs細(xì)胞的VEGFR2及其下游通路Akt/mTOR激活（P<0.01）。
　　4）使用 NAC后，VEGF誘導(dǎo)的HRMECs新生血管活動均有降低（P<0.01）。
　　4.TXNIP基因敲除對體外培養(yǎng)的小鼠視網(wǎng)膜新

28、生血管的影響
　　1）在缺乏VEGF刺激的條件下，體外培養(yǎng)的視網(wǎng)膜生長出新生血管芽的能力非常低，VEGF+MHG組較VEGF組小鼠視網(wǎng)膜新生血管能力增強(qiáng)（P＜0.05）。
　　2）TKO小鼠視網(wǎng)膜新生血管能力明顯降低（P＜0.01）。
　　3）TXNIP基因敲除對于小鼠玻璃體內(nèi)VEGF含量無明細(xì)影響。
　　結(jié)論：
　　1.中度高糖能引起HRMECs的遷移和管腔形成。這并不是由中度高糖刺激HRMECs自分泌產(chǎn)

29、生更多的VEGF引起，而是通過激活A(yù)kt/mTOR通路引起的。同時中度高糖也能引起HRMECs細(xì)胞內(nèi)ROS的短暫升高。
　　2.中度高糖能誘導(dǎo)HRMECs的TXNIP過表達(dá)，當(dāng)敲除HRMECs的TXNIP后，中度高糖引起的HRMECs遷移和管腔形成能力將被抑制。同時其激活A(yù)kt/mTOR信號通路的能力也被抑制。抗氧化劑NAC也可以抑制中度高糖誘導(dǎo)的HRMECs遷移和管腔形成能力。
　　3.敲除HRMECs的TXNIP將會抑制