慢性毒介導的miR-16高表達對小鼠垂體瘤細胞影響的初步研究.pdf

1、近年來備受關注的一類普遍存在于動、植物和病毒中的非編碼小RNA(ncRNA)-微小RNA(miRNAs)被認為是人體內最大的一類基因表達調控因子，調控超過30％的蛋白編碼基因的表達，影響著幾乎所有的信號通路，參與多種生理病理過程。通過調控基因的表達，miRNA在生物的生命過程中起著非常重要的作用，廣泛參與機體生長、發(fā)育、疾病發(fā)生等各種生命過程。
　　 作為一種可調控基因表達的內源性小分子，miRNA在腫瘤的基因治療中具有許多獨特

2、的優(yōu)勢。盡管miRNA與siRNA(short/small interfering RNA)起作用的方式相似，但典型的miRNA是靶向多個基因而不是一個基因。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是受到多個基因的調控，單靶點基因治療策略在臨床上存在較大的局限，而針對miRNA靶點的治療是多靶點聯(lián)合治療對于腫瘤的基因治療較單靶點治療更有優(yōu)勢，更有利于腫瘤的控制。依據(jù)內源性miRNA特異性調控基因表達的機理，miRNA模擬物(mimics)或抑制物(inhibit

3、ors)也逐漸被用于靶向抑制腫瘤相關基因的表達，克服了先前針對單個基因靶向治療效果差的弱點。
　　 miR-16-1作為發(fā)現(xiàn)最早和研究最廣泛的miRNAs之一，在人類miRNAs的功能研究中發(fā)揮了不容忽視的作用。miR-16是第一次將miRNAs和腫瘤聯(lián)系起來的兩個miRNAs之一，也是第一個發(fā)現(xiàn)有腫瘤抑制作用的miRNAs。Calin等發(fā)現(xiàn)hsa-miR-15a-16-1簇位于慢性B淋巴細胞白血病中經常缺失的13q14.3片段

4、中，這兩個miRNAs在68％的淋巴細胞白血病中表達缺失或降低。Cimmino等研究表明，在CLL中，hsa-miR-16-1和hsa-miR-15a在轉錄后水平負調控抗凋亡基因Bcl-2，且在CLL的模式細胞中用這兩個miRNAs的模擬物抑制Bcl-2表達能誘導細胞凋亡，說明這兩個miRNAs是Bcl-2的天然反義因子，可被用于治療Bcl-2高表達的腫瘤。Bonci等在前列腺癌中研究發(fā)現(xiàn)miR-16-1及miR-15a在晚期前列腺癌中

5、顯著降低，過表達miR-16-1和miR-15a后通過靶向CCND1、Bcl-2和WNT3A抑制了細胞存活、增殖和侵襲，說明miR-16-1及miR-15a有治療意義。垂體瘤是中樞神經系統(tǒng)繼膠質瘤和腦膜瘤之后第三位最常見的原發(fā)顱內腫瘤，嚴重影響患者的生活及生存質量，且手術后復發(fā)率高。近年，miRNAs在垂體腺瘤中的研究亦日益增多，多個研究表明miR-16-1在垂體腺瘤中較正常垂體低表達，且與幾個臨床因素相關，說明miR-16-1可能在垂

6、體瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用，而有關miR-16在垂體瘤細胞的作用及可能的作用機制國內外未見報道。
　　 本研究先驗證mmu-miR-16在AtT20細胞株低表達后，再通過設計能夠在小鼠AtT20垂體瘤細胞株中穩(wěn)定高效表達miR-16的慢病毒重組載體，研究該病毒載體感染AtT20細胞后對細胞的增殖與凋亡水平變化，明確miR-16能否作為未來進行垂體瘤基因治療的有效靶點，Bcl-2及CCND1是否是mmu-miR-16的垂體瘤

7、相關的潛在靶基因，為垂體瘤產生和發(fā)展的分子機制研究以及新治療方法的尋找提供新的線索和思路。
　　 第一部分 miR-16在小鼠正常垂體細胞和垂體瘤細胞表達的差異
　　 目的:檢測mmu-miR-16在小鼠正常垂體細胞和AtT20細胞株的差異性表達，確定AtT20細胞株是否是miR-16功能研究的體外模式細胞。
　　 方法:分別用培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠AtT20細胞株及小鼠正常垂體細胞。采用莖環(huán)實時熒光逆轉錄聚合酶鏈反應來

8、檢測mmu-miR-16在這兩株細胞的表達水平。先用RNAiso Plus試劑盒分別抽提兩種細胞的總RNA，用莖凸環(huán)引物逆轉錄為cDNA，然后用miR-16特異性引物進行實時熒光定量PCR，U6作為內參。mmu-miR-16的相對表達量用2-⊿⊿Ct方法計算，用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學意義分析。
　　 結果:mmu-miR-16在小鼠垂體瘤細胞系AtT20的表達水平較小鼠正常垂體細胞明顯下降，兩者有顯著性差異(P<0.05

9、)，在AtT20細胞株的表達量是正常垂體細胞的0.337倍。
　　 結論:
　　 1、mmu-miR-16在小鼠垂體瘤細胞系AtT20的表達水平較小鼠正常垂體細胞明顯下降，提示miR-16的異常表達與垂體腺瘤的發(fā)生發(fā)展有密切的聯(lián)系。
　　 2、AtT20細胞系可作為miR-16在垂體瘤中的功能研究的模式細胞。
　　 第二部分 miR-16慢病毒載體的制備、病毒的大量包裝及表達檢測
　　 目的:構建

10、有效的慢病毒表達載體，并篩選出高效的表達載體。
　　 方法:將mmu-miR-16-1基因序列導入Vector軟件，依據(jù)miRNA表達最優(yōu)原則在Vector中搜尋最優(yōu)序列2條，經單鏈片段的合成和退火后，分別克隆至pMAGic1.0載體的U6下游合適的酶切位點處，經酶切、測序鑒定正確后，將重組質粒與包膜質粒pMD2G、包裝質粒pMD1g-pRRE及REV表達質粒pRSV-Rev共轉染293T細胞產生慢病毒，48h后收集細胞上清，經

11、過濾后得到病毒原液，用Real-time PCR方法檢測病毒滴度，并感染AtT20細胞株后檢測miR-16的表達水平。
　　 結果:設計出2個特異的RNA序列，即miR-16-1-a和miR-16-1-b，成功構建了兩個重組慢病毒：pMAGic-miR-16-1-a和pMAGic-miR-16-1-b，測定病毒滴度結果為：pMAGic-miR-16-1-a重組慢病毒為1.015×108TU/TU/，pMAGic-miR-16-1

12、-b重組慢病毒為1.026×108TU/ml。Real-time PCR檢測了兩個慢病毒表達載體感染AtT20細胞株后miR-16的表達，其中pMAGic-miR-16-1-b重組慢病毒上調最為明顯(為感染前的3.6倍)，優(yōu)于pMAGic-miR-16-1-a重組慢病毒(僅為感染前的1.76倍)。
　　 結論:
　　 1、根據(jù)mmu-miR-16-1基因序列利用Vector軟件設計出2個特異性的RNA序列。
　　

13、 2、成功構建了能表達miR-16的兩組慢病毒表達載體：pMAGic-miR-16-1-a及pMAGic-miR-16-1-b慢病毒表達載體。
　　 3、成功篩選出能高效表達miR-16的慢病毒表達載體慢病毒。該載體能有效感染AtT20細胞株，滿足實驗要求。該載體的成功構建為深入開展mmu-miR-16對AtT20細胞株的生物學功能和靶標研究提供了有效的工具。
　　 4、選擇合適的MOI，能夠在低毒性的同時達到較高的感染

14、效率，而較高的MOI在AtT20細胞中產生較明顯的非特異性的毒性作用。
　　 第三部分 miR-16高表達對垂體瘤細胞增殖與凋亡的影響及機制
　　 目的:檢測高效表達mmu-miR-16的pMAGic-miR-16-1-b慢病毒重組載體感染AtT20細胞株后對細胞株增殖與凋亡水平的影響，闡明miR-16在腫瘤發(fā)生過程中的可能作用；檢測Bcl-2及CCND1是否為miR-16垂體腺瘤相關的潛在靶基因。
　　 方法:

15、將小鼠AtT20細胞分為3組：空白對照組、陰性對照組和實驗組，空白對照組不加任何處理，陰性對照組加入GFP病毒，而實驗組加入pMAGic-miR-16-1-b慢病毒表達顆粒(MOI=30)。應用流式細胞術及細胞活性實驗(MTT)方法來測定各組細胞的細胞周期、凋亡及增殖變化。應用Real-timePCR及western blot檢測Bcl-2及CCND1的mRNAs及蛋白表達水平的變化。
　　 結果:MTT結果示實驗組的生長速度較

16、空白對照組及陰性對照組明顯降低，曲線較平坦，而陰性對照線曲線較空白對照組略低。流式細胞儀結果示實驗組凋亡率明顯增加，較陰性對照及空白對照組有顯著性差異，而兩對照組之間無統(tǒng)計學意義。細胞周期結果顯示實驗組G0/G1期前有明顯的亞二倍體峰。實驗組Bcl-2蛋白表達水平及mRNA表達水平均較對照組明顯降低，而CCND1蛋白及mRNA水平較對照組略下降。
　　 結論:
　　 1、miR-16在垂體瘤細胞中扮演著抑制腫瘤的角色，通

17、過感染miR-16慢病毒可有效提高miR-16的抑瘤效應。
　　 2、上調mmu-miR-16通過靶向Bcl-2可抑制AtT20細胞的增殖，促進AtT20細胞的凋亡。
　　 3、Bcl-2是mmu-miR-16與垂體腺瘤相關的潛在靶基因，在垂體瘤中呈高表達，上調mmu-miR-16可降低其表達。
　　 4、miR-16是垂體瘤基因治療的候選靶點。
　　 5、對于CCND1是否為miR-16與垂體腺瘤相關的