GITR-GITRL在支氣管哮喘大鼠中性粒細(xì)胞及肺泡巨噬細(xì)胞上的表達(dá).pdf

1、目的:
　　 GITR/GITRL是一對共刺激分子，反映了體內(nèi)Treg的數(shù)量及功能狀況，參與了體內(nèi)復(fù)雜的免疫系統(tǒng)的反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠哮喘模型，檢測哮喘組、對照組和布地奈德干預(yù)組外周血PMN及肺泡巨噬細(xì)胞上的GITR/GITRL的表達(dá)情況，探討其與支氣管哮喘的關(guān)系及糖皮質(zhì)激素干預(yù)后對其表達(dá)的影響，為哮喘發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步完善及糖皮質(zhì)激素治療提供一定的理論依據(jù)，并為進(jìn)一步研究能否通過調(diào)節(jié)GITR/GITRL信號的共刺激活化途徑實(shí)

2、現(xiàn)哮喘的目標(biāo)性免疫調(diào)節(jié)性治療提供新的思路。
　　 方法:
　　 清潔級5周齡雄性健康SD大鼠，隨機(jī)分為哮喘組（A組）、布地奈德干預(yù)組（B組）、對照組（C組），每組10只，用OVA制備哮喘模型，C組以生理鹽水代替OVA進(jìn)行腹腔注射和霧化吸入，B組在激發(fā)階段予布地奈德混懸液霧化吸入治療。末次激發(fā)24小時(shí)后水合氯醛腹腔注射麻醉，心臟取血，結(jié)扎左肺留取肺組織，右肺行支氣管肺泡灌洗留取BALF。肺組織HE染色觀察病理變化;對血標(biāo)本

3、進(jìn)行PMN的分離提純，提取總RNA;計(jì)BALF沉渣中細(xì)胞總數(shù);對肺泡灌洗液中的肺泡巨噬細(xì)胞進(jìn)行分離、純化、細(xì)胞爬片、提取總RNA;采用免疫細(xì)胞化學(xué)法測定GITR/GITRL蛋白在肺泡巨噬細(xì)胞上的表達(dá);采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測GITR/GITRLmRNA在肺泡巨噬細(xì)胞及外周血PMN的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:
　　 1、成功構(gòu)建大鼠支氣管哮喘模型:激發(fā)階段觀察到A組大鼠出現(xiàn)呼吸加快、腹部肌肉抽搐、全身發(fā)紺等癥狀，嚴(yán)重

4、者呼吸減慢，節(jié)律紊亂，部分典型的大鼠哮喘發(fā)作時(shí)可聞及明顯的哮鳴音。HE染色鏡下見A組大鼠小支氣管、血管粘膜下和周圍的肺組織有明顯的炎性浸潤，以淋巴細(xì)胞、EOS、PMN為主。
　　 2、BALF的細(xì)胞數(shù):各組大鼠BALF的回收量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。BALF中的細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，A組、B組的BALF中細(xì)胞總數(shù)均高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.01)。B組和C組的細(xì)胞總數(shù)分別低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0

5、.01)。
　　 3、成功分離出外周血PMN:分離到的PMN其數(shù)量大于106/ml;瑞氏染色顯示，PMN呈圓形，胞質(zhì)淡紅色，部分胞核可見分葉狀。
　　 4、成功分離出肺泡巨噬細(xì)胞:顯微鏡下觀察分離到的肺泡巨噬細(xì)胞呈圓形、透亮，培養(yǎng)40min-50min左右，可觀察到肺泡巨噬細(xì)胞逐漸貼壁，形狀呈現(xiàn)多態(tài)性，為圓形、橢圓形或其他不規(guī)則形狀，胞質(zhì)較前豐富，2h后細(xì)胞貼滿培養(yǎng)瓶的底部，細(xì)胞呈圓形或星形，有些呈不規(guī)則形狀，部分細(xì)胞可

6、見偽足和突起。
　　 5、實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果: GITR/GITRLmRNA在各組的外周血PMN和肺泡巨噬細(xì)胞上均有表達(dá)，A組的外周血PMN和肺泡巨噬細(xì)胞GITR/GITRLmRNA相對表達(dá)水平高于C組和B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。而B組與C組的外周血PMN和肺泡巨噬細(xì)胞GITR/GITRLmRNA相對表達(dá)水平相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 6、肺泡巨噬細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果:各組的肺泡

7、巨噬細(xì)胞上GITR/GITRL均有表達(dá)，其陽性表達(dá)主要在胞膜與胞漿。陰性對照片無棕黃色顆粒，僅見復(fù)染的細(xì)胞核。A組肺泡巨噬細(xì)胞的GITR/GITRL蛋白表達(dá)水平高于C和B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。而B組與C組的肺泡巨噬細(xì)胞的GITR/GITRL蛋白表達(dá)水平相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 1、A組大鼠外周血PMN和肺泡巨噬細(xì)胞的GITR/GITRL表達(dá)高于C組，提示PMN和肺泡