支氣管哮喘急性發(fā)作時(shí)嗜酸粒細(xì)胞活化的分子機(jī)制研究.pdf

1、研究背景及意義： 支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱(chēng)哮喘)是一種嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的慢性呼吸道疾病，以氣道非特異性炎癥、氣道反應(yīng)性增高及氣道重建為主要特征。哮喘的發(fā)生與發(fā)展受多種基因的調(diào)控，從而決定淋巴細(xì)胞亞型，免疫反應(yīng)性，嗜酸粒細(xì)胞(Eosinophils，EOS)及肥大細(xì)胞的遷移、活化、細(xì)胞因子合成、粘附分子表達(dá)及組織修復(fù)過(guò)程。盡管哮喘基礎(chǔ)研究取得較大的進(jìn)步，哮喘的治療更多的還是依賴(lài)于糖皮質(zhì)激素、β2腎上腺素受體激動(dòng)劑等幾類(lèi)藥物。評(píng)估哮喘的指標(biāo)

2、仍以肺功能指標(biāo)、呼出氣-氧化氮及誘導(dǎo)痰EOS為主，因此哮喘臨床診治策略仍有待進(jìn)一步完善。 EOS與哮喘氣道炎癥、免疫調(diào)控、上皮細(xì)胞損傷、上皮下基質(zhì)沉積、氣道阻塞及肺功能下降等密切相關(guān)。臨床研究也顯示誘導(dǎo)痰EOS可作為哮喘臨床控制的有效指標(biāo)。2006年全球哮喘防治創(chuàng)議(Global Initiative for Asthma，GINA)明確指出：EOS可能在哮喘氣道重建過(guò)程中發(fā)揮重要作用，而氣道重建很可能是未來(lái)哮喘治療的新靶點(diǎn)。

3、 足夠證據(jù)表明EOS活化在哮喘發(fā)生發(fā)展中起重要作用，但其活化具體機(jī)制尚未完全闡明。近年來(lái)也有多項(xiàng)研究觀察到了EOS某些基因發(fā)生改變，但其更多的還是體外或者是觀察單一通路在EOS調(diào)控的機(jī)制?；谶@些問(wèn)題及哮喘疾病的復(fù)雜性，選擇體外或者單因素分析顯得非常局限，而選擇哮喘病人在不同病情狀態(tài)進(jìn)行基因表達(dá)譜分析有利于發(fā)現(xiàn)真正參與疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)的候選基因。因此本研究首先以哮喘患者不同時(shí)期EOS為主要對(duì)象進(jìn)行基因表達(dá)譜的分析。在獲得多種EOS

4、差異表達(dá)基因后，因?yàn)檠趸瘧?yīng)激和EOS遷移是哮喘的重要特征。因此我們分別選擇與哮喘氧化應(yīng)激、細(xì)胞骨架重建相關(guān)基因硫氧還蛋白結(jié)合蛋白2/維生素D3上調(diào)蛋白1(Thioredoxin-binding Protein 2/Vitamin D3 Up-regulated Protein1，VDUPI)、細(xì)胞骨架蛋白相關(guān)基因肌動(dòng)蛋白解聚因子/絲切肌動(dòng)蛋白slingshot磷酸酶2(SsH2L)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證及功能分析，為未來(lái)針對(duì)炎性靶細(xì)胞治療提供一

5、定的理論依據(jù)。 方法： 1．哮喘患者外周血EOS cDNA消減文庫(kù)構(gòu)建及鑒定 在1例明確診斷為哮喘患者急性發(fā)作時(shí)及緩解時(shí)分別提取外周血EOS總RNA，應(yīng)用Super SMART cDNA synthesis和SSH技術(shù)，構(gòu)建哮喘時(shí)EOS相關(guān)基因消減cDNA文庫(kù)，測(cè)序、通過(guò)差異篩選(Differential Screening，DS)對(duì)部分陽(yáng)性克隆進(jìn)行篩選驗(yàn)證，并進(jìn)行同源性對(duì)比分析。 2．哮喘患者VDUPl

6、和SSH-2L差異表達(dá)分析 共選取正常對(duì)照10例和哮喘患者發(fā)作期15例和緩解期15例，提取患者外周血EOS總RNA，應(yīng)用半定量RT-PCR和Western Blotting技術(shù)驗(yàn)證VDUP1和SSH-2L差異表達(dá)。 3．VDUPl與EOS活化關(guān)系及其在哮喘中的作用 研究對(duì)象來(lái)自于第二部分。留取患者誘導(dǎo)痰，測(cè)量誘導(dǎo)痰EOS％，用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，E

7、LISA)檢測(cè)患者血清嗜酸粒細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白(Eosinophil Cationic Protein，ECP)濃度。分析VDUP1表達(dá)與哮喘患者誘導(dǎo)痰EOS％、肺功能指標(biāo)一秒鐘用力呼氣容積占預(yù)計(jì)值百分比(Forced Expiratory Volume in One Second to Predicted Value，F(xiàn)EVI％)、最大呼氣流速占預(yù)計(jì)值百分LL(Peak Expiratory Flow to Predicted Value

8、，PEF％)及血清ECP濃度關(guān)系。 4．硫氧還蛋白(Thioredoxin，TRX)氧化劑和TRX硫醇基烷化劑對(duì)EOS的VDUP1作用環(huán)節(jié)的影響 以IL-5(EOS向肺部浸潤(rùn)、活化必需的細(xì)胞因子)刺激孵育正常EOS，同時(shí)用ELISA法檢測(cè)血清和培養(yǎng)上清液ECP濃度。研究VDUP1表達(dá)對(duì)EOS功能影響；因VDUPl功能發(fā)揮主要依賴(lài)于與TRX氧化還原中心相互作用而完成，因此在孵育的細(xì)胞中，兩組分別給予破壞TRX氧化還原中心的

9、TRX氧化劑二酰胺和烷化劑2,4二氯二硝基苯，阻斷VDUP1與TRX相互作用，通過(guò)觀察VDUP1表達(dá)變化與上清液中ECP含量，初步探討VDUP1與TRX相互作用及其參與EOS活化的可能機(jī)制。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 10.0軟件的One WayANOVA和Bivariate orrelations方法，組間比較采用LSD方法檢驗(yàn)。 結(jié)果： 1、成功構(gòu)建上調(diào)、下調(diào)兩個(gè)哮喘相關(guān)基因cDNA消減文庫(kù)，經(jīng)進(jìn)一步差異篩選，同源性對(duì)比

10、分析，篩選出與細(xì)胞骨架重建相關(guān)基因6個(gè)，包括SSH-2L，蛋白磷酸酶1催化亞單位B亞型，蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型6，蛋白酪氨酸磷酸酶非受體12，DOCk8，肌球蛋白輕鏈結(jié)合蛋白。與氧化應(yīng)激及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)基因8個(gè)，包括VDUPl、高移動(dòng)性蛋白2、水通道蛋白9、雙重特異磷酸酶1、跨膜蛋白BRI、糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合蛋白1、SNF-1相關(guān)激酶、DICEl等。 2、外周血EOS SSH2L相對(duì)表達(dá)量在哮喘發(fā)作組、緩解組及正常組分別為(1.

11、648±0.68)、(0.918±0.395)和(0.876±0.436)，其中發(fā)作組顯著高于正常組(n=5，P=0.038)與緩解組(n=5，P=0.047)，而緩解組基因表達(dá)與正常對(duì)照組無(wú)顯著差異(P=0.901)；VDUPlmRNA相對(duì)表達(dá)量在發(fā)作組、正常組及緩解組分別為(0.228±0.117)，(0.674±0.171)，(0.699±0.138)，發(fā)作組表達(dá)比正常組與治療組明顯降低(P=0.001)，而相應(yīng)蛋白相對(duì)水平分別為

12、(0.348 ± 0.147)，(0.402±0.121)，(0.422±0.163)，發(fā)作組蛋白水平也均顯著低于正常組及緩解組(P=0.001)。正常組與緩解組在mRNA水平(P=0.655)和蛋白水平(P=0.623)均無(wú)顯著差異。 3、血清ECP濃度在哮喘發(fā)作組、哮喘緩解組及正常對(duì)照分別為(4.41±1.36)ng/ml，(14.3±4.29)ng/ml，(6.70±1.40)ng/ml，誘導(dǎo)痰EOS％在三組分別為(1.3

13、5％±0.35％)、(11％±4.8％)、(3.6％±0.89％)。統(tǒng)計(jì)相關(guān)性分析表明，VDUP1表達(dá)與誘導(dǎo)痰EOS％(r=0.714，p=0.000)及血清ECP濃度(R=0.735，P=0.000)呈顯著負(fù)相關(guān)，而緩解組基因表達(dá)與對(duì)照組無(wú)顯著差異。 4、IL-5刺激下，EOS VDUP1表達(dá)顯著降低(P=0.000)，同時(shí)伴上清ECP顯著升高(P=0.000)。而應(yīng)用破壞VDUP1作用環(huán)節(jié)的TRX氧化劑二酰胺和烷化劑2,4二

14、氯二硝基苯并不影響IL-5對(duì)VDUP1表達(dá)的影響，但可使培養(yǎng)液上清的ECP濃度下降。 結(jié)論： 1、成功構(gòu)建上調(diào)、下調(diào)兩個(gè)哮喘相關(guān)基因cDNA消減文庫(kù)，經(jīng)篩選共獲得6個(gè)與細(xì)胞骨架重建的相關(guān)基因和8個(gè)與氧化應(yīng)激及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因，哮喘患者不同狀態(tài)的EOS基因表達(dá)可能不同； 2、SSH-2L基因在哮喘發(fā)作組外周血EOS顯著高表達(dá)，表明SSH-2L可能在調(diào)控EOS遷移、趨化方面發(fā)揮重要作用； 3、VDUPl表達(dá)可