哮喘大鼠肺泡巨噬細胞膜鉀通道活性及分泌功能的研究.pdf

1、目的: 支氣管哮喘是一種由多種細胞，包括炎性細胞(嗜酸性粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞和肺泡巨噬細胞等)、氣道結構細胞(氣道平滑肌細胞和上皮細胞等)和細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病。雖然已開展了較多關于哮喘的研究與治療工作，但由于哮喘的發(fā)病機制始終未得到完全闡明，因此，目前哮喘仍是無法治愈的疾病之一。 肺泡巨噬細胞(alveolar macrophage，AM)是定居在肺泡和氣道表面的重要免疫效應細胞，可以激

2、活炎癥反應消除入侵者。但是，過度的炎癥反應可以干擾氣體交換。這就意味著AM有兩方面相反的作用—即保護機體免受侵害和增強炎癥反應的作用。有研究顯示，AM占支氣管肺泡灌洗液(bronchus alveolar lavage fluid，BALF)中細胞總數(shù)的90％以上，但其在哮喘發(fā)病中的作用至今不是十分清楚。本實驗研究哮喘大鼠AM鉀通道活性的變化情況及其生成各種炎癥因子的變化從而分析AM在哮喘時功能狀態(tài)的變化及其可能的調(diào)控機制。 實

3、驗方法: 首先利用卵蛋白(ovialbumin，OVA)致敏并激發(fā)大鼠建立哮喘模型，對照組則用生理鹽水代替；HE染色觀察哮喘大鼠的病理學變化情況；末次激發(fā)后24小時將大鼠麻醉，進行氣管插管，用冷的PBS進行支氣管肺泡灌洗，每次10ml，重復五次，收集BALF，回收率可達90％以上，分離并培養(yǎng)AM。利用全細胞電壓鉗模式記錄AM細胞膜上的電壓依賴性鉀通道(Voltage—dependent potassium channel，Kv)

4、電流，觀察比較哮喘模型組和對照組Kv通道活性的變化；兩組細胞在利用LPS(5ug/ml)處理12小時前后，通過RT-PCR及Western blot方法檢測肺泡巨噬細胞中IL—6和TNF-α的轉錄及表達水平；利用大鼠ELISA檢測試劑盒檢測LPS(5ug/ml)處理12小時前后肺泡巨噬細胞培養(yǎng)上清液中IL—6和TNF-α的分泌水平。 實驗結果: 1、AM細胞膜Kv電流變化：病理學檢測發(fā)現(xiàn)哮喘模型組炎癥細胞浸潤明顯增加，有

5、大量紅細胞滲出，氣道平滑肌明顯增厚，管腔內(nèi)可見粘液栓；哮喘大鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)細胞總數(shù)顯著增高，與對照組比較差異顯著(P<0.01)，但AM百分比無明顯差異(P>0.05)；應用Kv通道特異性阻斷劑4—氨基吡啶(4—aminopyridine，4—AP)后電流幅度明顯降低，證實檢測到的AM細胞膜上的電流為Kv電流；哮喘大鼠AM細胞Kv電流密度為[(32.65±18.82)pA/pF，n=11]較對照組[(87.57±33.1

6、4) pA/pF，n=11]明顯降低(P<0.01)。 2、AM分泌IL—6、TNF-α等細胞因子的變化：LPS處理前后哮喘組AM轉錄、表達IL—6和TNF-α的水平與對照組相比均明顯增高(P<0.05)；LPS處理之前哮喘組AM分泌IL—6和TNF-α水平與對照組相比顯著增高(P<0.01)，LPS處理可使哮喘組與對照組的AM分泌IL—6和TNF-α水平均明顯增高(P<0.01)，但使對照組AM分泌IL—6和TNF-α的水平升