哮喘大鼠肺泡巨噬細(xì)胞膜鉀通道活性及分泌功能的研究.pdf

1、目的: 支氣管哮喘是一種由多種細(xì)胞，包括炎性細(xì)胞(嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞等)、氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞(氣道平滑肌細(xì)胞和上皮細(xì)胞等)和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病。雖然已開展了較多關(guān)于哮喘的研究與治療工作，但由于哮喘的發(fā)病機(jī)制始終未得到完全闡明，因此，目前哮喘仍是無法治愈的疾病之一。 肺泡巨噬細(xì)胞(alveolar macrophage，AM)是定居在肺泡和氣道表面的重要免疫效應(yīng)細(xì)胞，可以激

2、活炎癥反應(yīng)消除入侵者。但是，過度的炎癥反應(yīng)可以干擾氣體交換。這就意味著AM有兩方面相反的作用—即保護(hù)機(jī)體免受侵害和增強(qiáng)炎癥反應(yīng)的作用。有研究顯示，AM占支氣管肺泡灌洗液(bronchus alveolar lavage fluid，BALF)中細(xì)胞總數(shù)的90％以上，但其在哮喘發(fā)病中的作用至今不是十分清楚。本實(shí)驗(yàn)研究哮喘大鼠AM鉀通道活性的變化情況及其生成各種炎癥因子的變化從而分析AM在哮喘時(shí)功能狀態(tài)的變化及其可能的調(diào)控機(jī)制。 實(shí)

3、驗(yàn)方法: 首先利用卵蛋白(ovialbumin，OVA)致敏并激發(fā)大鼠建立哮喘模型，對(duì)照組則用生理鹽水代替；HE染色觀察哮喘大鼠的病理學(xué)變化情況；末次激發(fā)后24小時(shí)將大鼠麻醉，進(jìn)行氣管插管，用冷的PBS進(jìn)行支氣管肺泡灌洗，每次10ml，重復(fù)五次，收集BALF，回收率可達(dá)90％以上，分離并培養(yǎng)AM。利用全細(xì)胞電壓鉗模式記錄AM細(xì)胞膜上的電壓依賴性鉀通道(Voltage—dependent potassium channel，Kv)

4、電流，觀察比較哮喘模型組和對(duì)照組Kv通道活性的變化；兩組細(xì)胞在利用LPS(5ug/ml)處理12小時(shí)前后，通過RT-PCR及Western blot方法檢測肺泡巨噬細(xì)胞中IL—6和TNF-α的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)水平；利用大鼠ELISA檢測試劑盒檢測LPS(5ug/ml)處理12小時(shí)前后肺泡巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL—6和TNF-α的分泌水平。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 1、AM細(xì)胞膜Kv電流變化：病理學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)哮喘模型組炎癥細(xì)胞浸潤明顯增加，有

5、大量紅細(xì)胞滲出，氣道平滑肌明顯增厚，管腔內(nèi)可見粘液栓；哮喘大鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)細(xì)胞總數(shù)顯著增高，與對(duì)照組比較差異顯著(P<0.01)，但AM百分比無明顯差異(P>0.05)；應(yīng)用Kv通道特異性阻斷劑4—氨基吡啶(4—aminopyridine，4—AP)后電流幅度明顯降低，證實(shí)檢測到的AM細(xì)胞膜上的電流為Kv電流；哮喘大鼠AM細(xì)胞Kv電流密度為[(32.65±18.82)pA/pF，n=11]較對(duì)照組[(87.57±33.1

6、4) pA/pF，n=11]明顯降低(P<0.01)。 2、AM分泌IL—6、TNF-α等細(xì)胞因子的變化：LPS處理前后哮喘組AM轉(zhuǎn)錄、表達(dá)IL—6和TNF-α的水平與對(duì)照組相比均明顯增高(P<0.05)；LPS處理之前哮喘組AM分泌IL—6和TNF-α水平與對(duì)照組相比顯著增高(P<0.01)，LPS處理可使哮喘組與對(duì)照組的AM分泌IL—6和TNF-α水平均明顯增高(P<0.01)，但使對(duì)照組AM分泌IL—6和TNF-α的水平升