哮喘豚鼠肺泡巨噬細(xì)胞中SH2-Bβ的表達(dá)及NGF-TrkA對(duì)其調(diào)控機(jī)制.pdf

1、目的： 支氣管哮喘是一種復(fù)雜的疾病，氣道炎癥反應(yīng)和氣道高反應(yīng)性是哮喘的重要病理生理學(xué)特點(diǎn)。而氣道炎癥和高反應(yīng)性是通過(guò)免疫細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞的雙向信號(hào)調(diào)節(jié)完成的，故在哮喘的研究中尋找免疫細(xì)胞與神經(jīng)細(xì)胞之間的雙向信號(hào)分子成為焦點(diǎn)。研究表明神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor,NGF)是這一雙向信號(hào)分子。而NGF發(fā)揮的多種生物學(xué)功能通常是通過(guò)與其高親和力受體-酪氨酸激活酶受體A(trosine kinase recepto

2、r A,TrkA)結(jié)合后來(lái)來(lái)完成的。SH2-Bβ是位于細(xì)胞膜上的一種蛋白，研究發(fā)現(xiàn)它是TrkA的結(jié)合蛋白，NGF可以興奮SH2-B β經(jīng)SH2-Bβ的SH2-B區(qū)與TrkA相聯(lián)系，使SH2-Bβ發(fā)生酪氨酸磷酸化，再作用于AKT/PKB，促使AKT/PKB進(jìn)一步激活。但SH2-Bβ是否參與了哮喘的發(fā)病以及是否也是通過(guò)此傳導(dǎo)途徑起作用目前尚不清楚。肺泡巨噬細(xì)胞(alveolar macrophages，AMs)是聯(lián)系免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的紐帶

3、。故以AMs為研究對(duì)象，探討SH2-Bβ在AMs的表達(dá)以及是否通過(guò)NGF-TrkA-SH2-Bβ傳導(dǎo)途徑在哮喘中發(fā)揮作用，從而從細(xì)胞內(nèi)生物信號(hào)傳導(dǎo)角度闡明AMs在哮喘發(fā)病的分子生物學(xué)機(jī)制的作用，并為探討哮喘治療新的靶點(diǎn)及更有針對(duì)性地采取防治措施提供重要的科學(xué)依據(jù)。 材料與方法： 1、哮喘豚鼠模型的制備 清潔級(jí)健康雄性白化豚鼠60只，體重250-300g，隨機(jī)分為5組：(1)PBS對(duì)照組(n=10)；(2)哮喘組(

4、n=12)；(3)anti-NGF抗體組(n=14)；(4)anti-TrkA抗體組(n=14)；(5)布地奈德混懸液組(n=10)。實(shí)驗(yàn)第1天，(2)(3)(4)(5)組腹腔注射10％卵蛋白(ovalbumin,OVA)(含等量氫氧化鋁凝膠)1ml,對(duì)照組(1)腹腔注射PBS1ml．第15天(2)(3)(4)(5)組進(jìn)行超聲霧化吸入0.5％OVA，每天一次，每次2～5分鐘左右至喘息發(fā)作，共5天，但(3)(4)(5)組在吸入0.5％OV

5、A前3小時(shí)分別給與anti-NGF抗體、anti-TrkA抗體、布地奈德混懸液干預(yù)，每天1次，共5天。對(duì)照組用PBS超聲霧化，時(shí)間同哮喘組。 2、氣道反應(yīng)性測(cè)定 最后一次吸入OVA 24小時(shí)內(nèi)檢測(cè)氣道反應(yīng)性，戊巴比妥腹腔注射麻醉，將對(duì)照組、哮喘組、布地奈德組豚鼠應(yīng)用AniRes2005動(dòng)物肺功能分析系統(tǒng)(北京貝蘭博科技有限公司)檢測(cè)氣道阻力(包括吸氣阻力和呼氣阻力)。 3、血管灌注，豚鼠處死，留取血清及支氣管肺泡

6、灌洗液(BALA)和肺組織BALF細(xì)胞成分計(jì)數(shù)。 ELISA法檢測(cè)BALF上清中IL-4及IL-1β水平。各組肺組織HE病理檢測(cè)。 4、AMs的純化 BALF離心后沉淀細(xì)胞加入10％FCS-1640，放入培養(yǎng)瓶和事先放有蓋玻片的24孔板內(nèi)放入5％CO2孵箱內(nèi)貼壁培養(yǎng)2小時(shí)。將24孔板內(nèi)的蓋玻片取出沖洗干凈做免疫熒光染色和免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)，培養(yǎng)瓶中貼壁的AMs用0.02％EDTA-Na2消化下后收集，-70℃凍存待

7、測(cè)免疫印跡。 5、HE染色觀察肺組織病理學(xué)變化 將各組豚鼠肺組織用石蠟包埋、切片(5μm)后，進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察并照相。 6、熒光染色觀察SH2-Bβ在對(duì)照組和哮喘組豚鼠AMs的表達(dá) 將有AMs的蓋玻片用4％多聚甲醛固定30分鐘，PBS洗片后做SH2-Bβ熒光染色(TRITC-SH2-Bβ)。熒光顯微鏡觀察并照相。 7、免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)AMs中SH2-Bβ、TrkA的表達(dá) 取對(duì)照

8、組、哮喘組、anti-NGF哮喘組、anti-TrkA哮喘組、布地奈德組AMs爬片，參照二步法免疫細(xì)胞化學(xué)試劑盒步驟測(cè)定SH2-Bβ表達(dá)情況。相同方法檢測(cè)對(duì)照組、哮喘組、anti-NGF哮喘組AMs爬片的TrkA表達(dá)。 8、Western blot檢測(cè)AMs中SH2-Bβ、TrkA的表達(dá)、圖像分析 AMs中蛋白提取和定量后，取等量樣品進(jìn)行聚丙烯凝膠電泳，經(jīng)一抗和二抗孵育后顯色，照相并分析。 9、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

9、 所有原始數(shù)據(jù)采用SPSS11.5分析軟件進(jìn)行處理分析，所有結(jié)果均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±SD)，樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)方法，正態(tài)分布及方差齊時(shí)，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)；非正態(tài)分布采用秩和檢驗(yàn)，P<0.05為有差異顯著性。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1、哮喘豚鼠模型支氣管肺組織病理檢測(cè)： 支氣管肺組織病理學(xué)HE染色顯示，可見對(duì)照組豚鼠支氣管肺組織結(jié)構(gòu)基本正常；哮喘組豚鼠氣管管腔狹窄，氣

10、管壁內(nèi)及管周以EOS、LC為主炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，證實(shí)了本實(shí)驗(yàn)中豚鼠哮喘模型符合支氣管哮喘。anti-NGF組、anti-TrkA組、布地奈德組模型的病理變化均較哮喘組有所減輕。 2、氣道反應(yīng)性測(cè)定哮喘組豚鼠對(duì)Ach的濃度反應(yīng)曲線明顯上移，其呼氣阻力及吸氣阻力均較正常對(duì)照組明顯升高(P<0.01或P<0.05)，表明哮喘實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ统晒?。而給與布地奈德霧化吸入后，氣道阻力較哮喘組明顯改善。 3、免疫熒光結(jié)果： 在正常對(duì)

11、照組豚鼠和哮喘組豚鼠支氣管肺泡灌洗液AMs中均有SH2-Bβ的表達(dá)，且主要在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)上。并發(fā)現(xiàn)哮喘組的表達(dá)強(qiáng)于正常對(duì)照組。 4、免疫細(xì)胞化學(xué)染色及分析正常對(duì)照組、哮喘組、anti-NGF哮喘組、anti-TrkA哮喘組及布地奈德混懸液組AMs中均有SH2-Bβ的表達(dá)，但強(qiáng)弱不同，哮喘組明顯高于其他四組(P<0.01)。TrkA蛋白在正常對(duì)照組、哮喘組、anti-NGF組豚鼠AMs中表達(dá)不同，哮喘組高于對(duì)照組及anti-NG

12、F哮喘組(P<0.01)。 5、免疫印記(western blot)檢測(cè)SH2-Bβ及TrkA的表達(dá)各組AMs中SH2-Bβ蛋白含量不同，哮喘組高于正常對(duì)照組、anti-NGF抗體組、anti-TrkA抗體組及布地奈德混懸液組(P<0.01)。正常對(duì)照組哮喘組、anti-NGF哮喘組AMs中TrkA表達(dá)不同，哮喘組高于對(duì)照組及anti-NGF哮喘組(P<0.05)。 6、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)豚鼠支氣管肺泡灌洗液中IL-1

13、β及IL-4的水平OVA致敏的哮喘豚鼠支氣管肺泡灌洗液中IL-1β、IL-4的水平較正常對(duì)照組及布地奈德混懸液組升高，兩兩比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。 結(jié)論： 1、SH2-Bβ在豚鼠AMs細(xì)胞中有表達(dá)，且哮喘組明顯高于正常對(duì)照組，提示SH2-Bβ可能參與了哮喘的發(fā)病。 2、在豚鼠哮喘模型的AMs中，NGF及TrkA可以調(diào)控SH2-Bβ的表達(dá)，而NGF又可影響TrkA的表達(dá)，提示SH2-Bβ可能