NGF介導(dǎo)的SH2-Bβ和Akt-PKB信號(hào)通路在小鼠氣道過敏性免疫反應(yīng)中的作用.pdf

1、前言
　　 支氣管哮喘(bronchial asthma,簡稱哮喘),是由多種炎性細(xì)胞特別是巨噬細(xì)胞,肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等參與的慢性氣道炎癥。國內(nèi)外支氣管哮喘患病率,死亡率逐漸上升,全世界支氣管哮喘者約1億人,成為嚴(yán)重威脅人們健康的主要慢性疾病。我國的哮喘發(fā)病率為1％,兒童達(dá)3％。神經(jīng)生長因子(Nervegrowth factor,NGF)在炎癥反應(yīng)中起重要作用,被認(rèn)為是連接神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的紐帶,許多研究都證

2、明NGF參與哮喘發(fā)病,它通過提高氣道高反應(yīng)和誘導(dǎo)氣道炎癥參與哮喘發(fā)病,阻斷NGF后可有效減輕哮喘病理變化和降低多種炎性因子的表達(dá)。但是NGF參與哮喘發(fā)病的機(jī)制尚不完全清楚。
　　 NGF促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞分化、發(fā)育和營養(yǎng)等生物學(xué)作用主要是通過結(jié)合其高親合力特異性受體TrkA(tyrosine kinase receptor A)實(shí)現(xiàn)的。此外,神經(jīng)生長因子介導(dǎo)SH2-Bβ(Src homology 2β)-Akt/PKB(protein

3、 kinase B,逆轉(zhuǎn)錄病毒Akt8癌基因V-akt編碼的蛋白產(chǎn)物,故也稱Akt)是調(diào)節(jié)嗜鉻細(xì)胞瘤(PC12)細(xì)胞的信號(hào)途徑之一。SH2-Bβ是廣泛表達(dá)的高度保守的調(diào)節(jié)蛋白家族成員之一,能結(jié)合非酪氨酸激酶2(Janus kinase 2,Jas2)、胰島素受體酪氨酸激酶和胰島素樣生長因子、NGF、血小板衍生因子、和成纖維細(xì)胞因子。SH2-Bβ對(duì)NGF依賴的軸突生長和軸突存活非常關(guān)鍵。SH2-Bβ加強(qiáng)NGF在PC12細(xì)胞中Akt的磷酸化

4、和延長Akt酶活性(NGF激活TrkA使其與SH2-B結(jié)合,促使SH2-B發(fā)生酪氨酸磷酸化之后作用于絲氨酸/蘇氨酸激酶Akt/PKB,Akt進(jìn)一步激活分叉頭轉(zhuǎn)錄因子(Forkhead transcriptionfactors),促使PC12細(xì)胞分化增殖。研究表明SH2-Bβ在哮喘豚鼠肺組織巨噬細(xì)胞中過表達(dá),同時(shí)還證明它參與NGF與其受體TrkA介導(dǎo)的哮喘發(fā)病。這些研究表明SH2-Bβ在NGF介導(dǎo)的細(xì)胞功能中發(fā)揮基礎(chǔ)性作用?；谝陨闲畔?

5、我們推測SH2-Bβ調(diào)節(jié)Akt磷酸化可能參與NGF介導(dǎo)的哮喘發(fā)病。
　　 本課題利用哮喘小鼠模型,以肺組織為研究對(duì)象,觀察Akt在哮喘肺組織及炎性細(xì)胞中的表達(dá)情況,觀察NGF和SH2-Bβ與氣道高反應(yīng)的關(guān)系,觀察阻斷NGF和SH2-Bβ肺組織病理變化和炎性細(xì)胞數(shù)量的變化,應(yīng)用多種方法觀察NGF和SH2-Bβ在哮喘發(fā)病機(jī)制中對(duì)Aukt及其活性的影響。為探討NGF介導(dǎo)的哮喘的可能的發(fā)病機(jī)制和尋找過敏性氣道疾病新的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)

6、。
　　 材料和方法
　　 一、主要試劑
　　 卵清蛋白(OVA,sigma,美國)；乙酰甲膽堿(mAch,sigma,美國)；RPMI1640培養(yǎng)基(GIBCO)；定點(diǎn)突變試劑盒(Stratagene,美國)；兔抗鼠NGF抗體(Sigma,美國)；定點(diǎn)突變試劑盒(Stratagene,美國)；鼠多克隆p-Akt抗體(CellSignaling,美國),辣根過氧化酶免疫組化試劑盒(SABC,博士德,中國);ECL

7、(enhanced chemiluminescence)試劑盒(Sigma Chemical,美國):Trizol裂解液(Santa Cruz,美國)；RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0(Takara Biotechnology,中國大連)；RNAout(Takara Biotechnology,中國)。
　　 二、主要儀器
　　 電子天平(BS110S,Startorius,德國)；恒溫冷凍切片機(jī)(Leic

8、e,德國)；-80℃深低溫冰箱(Toshiba,日本)；低溫冷凍超速離心機(jī)(3K18,Hitachi,Japan)；超聲粉碎機(jī)(Dr.Hielscher,德國)；通用電泳儀(Bio-Rad,美國)；普通光學(xué)顯微鏡(COIC,XSZ-H)；超純水系統(tǒng)(Millipore A10):MILLIPOREMILLI-B(美國)；超聲霧化器(JWC-201D型,北京超聲儀器廠)；AniRes2005動(dòng)物肺功能分析系統(tǒng)(北京貝蘭博科技有限公司)；M

9、etaMorph顯微圖像分析系統(tǒng)(UIC/OLYMPUS)；GDS8000凝膠圖像處理系統(tǒng)；PCR儀(Biometra,德國):Motic Images Advanced 3.2(Motic,Xiamen)。
　　 三、實(shí)驗(yàn)方法
　　 1、動(dòng)物及分組
　　 雌性BALB/c小鼠85只,6～8周齡,體重20.0～22.0 g,清潔級(jí),購自中國科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育中心。隨機(jī)分為4組:正常對(duì)照組,OVA組(哮喘組),R5

10、55E組,NGF阻斷組。
　　 2、哮喘模型復(fù)制及給藥方法
　　 1 mg OVA(Sigma,St Louis,MO,USA)和100mg氫氧化鋁溶于0.5 ml PBS中,分別于0,7,14和21天腹腔注射給OVA組,R555E組和anti-NGF組小鼠致敏,從22天到30天霧化吸入10 mg/ml OVA PBS激發(fā)哮喘,每天一次,每次30分鐘。OVA組繼續(xù)霧化激發(fā)三天,而R555E組和anti-NGF組分別在激發(fā)

11、前3小時(shí)尾靜脈注射以1:10稀釋于PBS中的50 μl多克隆抗體兔抗鼠R555E和NGF,連續(xù)三天。正常組以等量的PBS腹腔注射和霧化吸入。
　　 3、氣道反應(yīng)性測定
　　 采用梯度濃度的mAch激發(fā)氣道高反應(yīng),AniRes2005動(dòng)物肺功能分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。測定小鼠氣道阻力。
　　 4、組織切片的準(zhǔn)備
　　 以上各組動(dòng)物用多聚甲醛固定,取肺,相同位置切片。
　　 5、免疫組織化學(xué)方法測定肺組織A

12、kt表達(dá)。
　　 6、肺泡灌洗液(BAlF)細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類計(jì)數(shù)。
　　 用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù),涂片進(jìn)行Wright Giemsa染色作細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。
　　 7、免疫熒光測定p-Akt表達(dá)情況。
　　 8、Western blot測定p-Akt蛋白水平,圖像分析及數(shù)據(jù)處理。
　　 9、RT-PCR檢測Akt mRNA表達(dá),圖像分析及數(shù)據(jù)處理。
　　 10、蘇木素伊紅(HE)染色觀察肺組織

13、病理變化。
　　 常規(guī)包埋,冰凍切片,進(jìn)行蘇木素伊紅(HE)染色,觀察肺組織病理變化。
　　 11、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 所有數(shù)據(jù)采用SPSS14.0軟件分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示。P<0.05為差異有顯著性。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 1、呼吸頻率計(jì)數(shù)
　　 呼吸頻率各組無明顯差異(P>0.05)。
　　 2、支氣管和肺組織病理變化
　　 炎癥細(xì)胞,粘膜水腫和上皮損傷anti-N

14、GF組和R555E組小鼠沒有未加干預(yù)的哮喘鼠明顯(P<0.01)。在哮喘肺組織肺泡和支氣管周圍發(fā)現(xiàn)許多炎性細(xì)胞包括單核細(xì)胞,巨噬細(xì)胞,淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞。而正常鼠肺組織沒有上述變化。
　　 3、BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類
　　 炎癥細(xì)胞,粘膜水腫和上皮損傷anti-NGF組和R555E組小鼠沒有未加干預(yù)的哮喘鼠明顯(P<0.01)。OVA組小鼠的BALF的總細(xì)胞數(shù)明顯高于正常鼠。巨噬細(xì)胞,嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)與NGF

15、組和R555E組比較OVA組明顯升高。在NGF組和R555E組小鼠肺組織上述變化與OVA組比較明顯減輕。
　　 4、氣道阻力測定
　　 哮喘鼠對(duì)MCH的氣道反應(yīng)性比正常鼠增強(qiáng)(P<0.01)。靜脈注射NGF抗體和R555E的OVA致敏鼠氣道反應(yīng)性明顯低于OVA哮喘鼠。
　　 5、免疫組織化學(xué)染色
　　 哮喘組Akt/PKB在各種炎性細(xì)胞表達(dá),包括嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞等,并

16、且這些炎性細(xì)胞非常多,肺泡內(nèi)見大量的巨噬細(xì)胞,淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞等。正常組和NGF阻斷組炎性細(xì)胞表達(dá)Akt/PKB很少,并且炎性細(xì)胞非常少。
　　 6、免疫熒光分析NGF和SH2-Bβ對(duì)Akt活性影響
　　 肺組織免疫熒光染色顯示在OVA組p-Akt水平與正常組比較明顯高表達(dá)。而上述部位過表達(dá)的p-Akt水平在NGF組和R555E組又呈降低趨勢。
　　 7、免疫印跡法分析p-Akt蛋白表達(dá)
　　 在正常鼠的

17、肺組織p-Akt蛋白表達(dá)處于低水平,而在OVA組則明顯升高。NGF組和R555E組由OVA上調(diào)的p-Akt水平反而降低。
　　 8、Anti-NGF和R555E對(duì)Akt mRNA的影響
　　 OVA組Akt mRNA水平明顯高于正常組,而NGF組和R555E組致敏鼠的Akt mRNA水平與OVA組比較明顯降低。
　　 結(jié)論
　　 1、哮喘小鼠氣道高反應(yīng)明顯增高,NGF參與哮喘小鼠的氣道高反應(yīng)和肺部炎癥反應(yīng)