染料木素在小鼠過敏性腹瀉模型中抗過敏作用及作用機制的研究.pdf

1、近年來食物過敏的發(fā)病率不斷增加，這類疾病在嚴重時會導致過敏性休克，甚至死亡。對于食物過敏，目前還沒有有效的治療方法，嚴格避免與過敏原接觸是臨床上最重要的預防措施。染料木素(Genistein，GEN)是從大豆中提取的一種異黃酮類化合物，具有一定的免疫調節(jié)作用，由于其在乳腺癌、前列腺癌、心血管疾病、骨質疏松和絕經(jīng)后綜合癥等疾病中的重要作用日益受到人們的關注。近年來臨床上和實驗室的大量研究表明染料木素具有一定的抗過敏作用，因此，本論文通過如

2、下3個動物試驗研究GEN在食物過敏性腹瀉中的抗過敏作用，并對其可能的作用機制進行探討:(1)在亞屏障環(huán)境下通過口服卵清蛋白構建BALB/c小鼠的過敏性腹瀉模型，并對該模型中過敏反應和腸道菌群的變化進行分析;(2)分別在日糧中添加10 mg/kg和100 mg/kg的GEN，研究其對過敏性腹瀉模型中過敏癥狀、過敏反應和腸道菌群的影響;(3)通過每天給BALB/c小鼠灌胃2 mg/kg BW和20 mg/kg BW的GEN，研究其對過敏性腹

3、瀉模型中腸粘膜屏障的影響。
　　 1.亞屏障環(huán)境下構建食物過敏性腹瀉模型
　　 本實驗旨在亞屏障環(huán)境下構建BALB/c小鼠的食物過敏性腹瀉模型。首先用卵清蛋白（Ovalbumin，OVA）對雄性BALB/c小鼠進行致敏，然后灌胃OVA誘導急性腹瀉，建立BALB/c小鼠過敏性腹瀉模型。ELISA檢測血清OVA-特異性IgG1和總IgE水平，氯乙酸酯酶染色法計數(shù)空腸肥大細胞。結果發(fā)現(xiàn)，處理組小鼠經(jīng)反復灌胃后出現(xiàn)腹瀉，而對照組

4、小鼠始終沒有出現(xiàn)腹瀉;與對照組小鼠相比，處理組小鼠血清OVA-特異性IgG1和總IgE水平均顯著升高，空腸肥大細胞數(shù)量顯著增加。這些結果表明，可以在亞屏障環(huán)境下通過口服OVA成功誘導BALB/c小鼠產生過敏性腹瀉，建立食物過敏性腹瀉模型。
　　 2.食物過敏性腹瀉模型中腸道菌群的變化
　　 本研究旨在比較亞屏障環(huán)境下過敏性腹瀉模型中腸道菌群的變化。本實驗運用基于16S rRNA基因的PCR-DGGE技術和Real-tim

5、e PCR技術分析結腸細菌菌群的變化。PCR-DGGE分析表明，致敏組和假致敏組小鼠結腸細菌菌群結構存在差異。Real-timePCR定量分析結果顯示，OVA致敏組小鼠結腸乳酸桿菌數(shù)量顯著減少，而雙歧桿菌和總細菌數(shù)量變化不顯著。提示食物過敏性腹瀉小鼠結腸菌群結構失衡，特別是乳酸桿菌數(shù)量減少。
　　 3.GEN對食物過敏性腹瀉的影響
　　 本研究旨在探討OVA誘導的BALB/c小鼠過敏性腹瀉模型中GEN的抗過敏作用。64只

6、6～8周齡BALB/c，雌雄各半，隨機分為8組(n=8)，分別為陰性對照組、陽性對照組、低劑量GEN素組(2 mg/kg BW/d)和高劑量GEN組（20 mg/kg BW/d），GEN通過添加到日糧中的方式給藥。每次灌胃后觀察并記錄小鼠的腹瀉狀況，實驗過程中記錄小鼠的體重和日采食量，用于GEN攝入量的校正。結果發(fā)現(xiàn)，低GEN處理緩解雌鼠腹瀉，高GEN處理加劇雌鼠腹瀉;低GEN和高GEN處理均加劇雄鼠過敏性腹瀉。這些結果表明，GEN對小

7、鼠過敏性腹瀉的作用具有劑量效應和性別效應。經(jīng)校正后低劑量組雌鼠和雄鼠GEN實際攝入量分別為1.22 mg/kg BW和1.42 mg/kgBW，高劑量組分別為12.2 mg/kg BW和14.2 mg/kg BW。
　　 4.GEN對食物過敏性腹瀉模型中過敏反應的影響
　　 之前的研究結果表明合適劑量的GEN處理對雌鼠過敏性腹瀉具有一定的緩解作用，本研究從免疫學角度探討GEN在過敏性腹瀉模型中的抗過敏機制。比色法測定空腸

8、和結腸組織中髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性，Real-time PCR法測定空腸細胞因子的表達水平，ELISA法檢測血清OVA-特異性IgG1和總IgE水平，氯乙酸酯酶染色法計數(shù)空腸肥大細胞。結果發(fā)現(xiàn)，與陰性對照組相比，陽性對照組小鼠空腸和結腸MPO活性顯著增加;空腸IL-13表達顯著增加，而IFN-γ和IL10表達顯著減少;血清OVA-IgG1和總IgE均顯著增加;空腸和結腸肥大細胞數(shù)量均顯著增加。與陽性對

9、照組相比，低劑量GEN處理可以顯著降低空腸MPO活力;顯著降低空腸IL-13表達，并提高IFN-γ表達;顯著降低空腸肥大細胞數(shù)量。與陽性對照組相比，高劑量GEN處理可以顯著增加空腸肥大細胞數(shù)量。這些結果表明GEN通過改善腸道Th1/Th2平衡、抑制腸粘膜肥大細胞增生發(fā)揮其抗過敏作用。
　　 5.GEN對食物過敏性腹瀉模型中腸道菌群的影響
　　 腸道菌群與宿主相互作用在預防過敏性疾病發(fā)生中發(fā)揮重要作用，本實驗主要研究OVA

10、誘導過敏性腹瀉后小鼠腸道菌群結構的變化，以及GEN處理對腸道菌群結構的影響。本實驗運用基于16S rRNA基因的PCR-DGGE技術和Real-time PCR技術分別對小鼠糞樣，結腸內容物，以及空腸、回腸和結腸粘膜中腸道菌群的結構和數(shù)量進行分析。DGGE分析結果表明:小鼠糞樣菌群結構在各實驗組間無明顯變化;小鼠結腸內容物和結腸粘膜菌群結構在各實驗組間出現(xiàn)條帶差異，在P組和H組中出現(xiàn)的一些條帶經(jīng)鑒定為Helicobacter typhl

11、onicus，Desulfovibrio sp.ABHU2SB和Shigellaflexneri的最相似菌。相似性分析結果也發(fā)現(xiàn)不同組別樣品分布在不同的簇。定量分析結果表明:結腸粘膜和內容物中大腸桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌、梭菌Ⅳ群、擬桿菌和總細菌均存在顯著地分布差異，雙歧桿菌、擬桿菌和總細菌存在顯著的組別差異;空腸、回腸和結腸粘膜中乳酸桿菌、雙歧桿菌和梭菌Ⅳ群存在顯著地分布差異，乳酸桿菌存在顯著的組別差異。這些結果表明，OVA誘導過敏性

12、腹瀉后，小鼠腸道菌群結構發(fā)生變化，特別是出現(xiàn)了一些與腸道炎癥相關的病原菌，合適劑量的GEN處理可以抑制這些病原菌的定植，改善腸道菌群結構。
　　 6.GEN對食物過敏性腹瀉模型中腸粘膜屏障的影響
　　 大量研究表明食物過敏患者中存在明顯的腸道屏障功能損傷，本實驗主要研究OVA誘導過敏性腹瀉后小鼠腸道屏障結構的變化，以及GEN處理對腸道屏障結構的影響。32只雌性BALB/c小鼠隨機分為4組(n=8)，分別為生理鹽水假致敏的

13、陰性對照組和OVA致敏的陽性對照組、低劑量染料木素(2mg/kg BW)組和高劑量染料木素(20mg/kg BW)組，染料木素通過灌胃的方式給藥。實驗結束后，記錄所有小鼠的腹瀉狀況;HE染色觀察小鼠空腸組織形態(tài)的變化;透射電鏡觀察小鼠空腸粘膜上皮細胞間連接的變化;Real-time PCR和Western blot分別用于空腸粘膜緊密連接蛋白Occludin，Claudin-1和ZO-1的mRNA水平和蛋白水平的表達分析;并對空腸肥大細

14、胞數(shù)量和緊密連接蛋白表達進行相關性分析。HE染色結果表明相比于陰性對照組，陽性對照組小鼠絨毛變短、隱窩加深，絨毛高度和隱窩深度的比值顯著降低;電鏡結果表明陽性對照組小鼠空腸粘膜上皮細胞間連接嚴重受損;Real-timePCR和Westernblot結果表明陽性對照組小鼠空腸粘膜緊密連接蛋白Occludin，Claudin-1和ZO-1的表達均顯著降低。相比于陽性對照組，低劑量染料木素處理緩解OVA誘導的過敏性腹瀉，顯著提高絨毛高度和隱窩

15、深度的比值，改善空腸粘膜上皮細胞間連接，顯著提高Claudin-1的mRNA表達水平和明顯增加Occludin和ZO-1的蛋白表達量;而高劑量染料木素則加重小鼠的過敏反應，進一步降低Occludin的蛋白表達量。相關性分析結果表明，空腸粘膜肥大細胞的數(shù)量與空腸粘膜Occludin的mRNA表達水平呈顯著地線性負相關。這些結果表明，OVA誘導過敏性腹瀉后，小鼠腸道屏障結構受損，合適劑量的GEN處理對腸粘膜屏障結構具有保護作用，且腸道屏障結