基于TLRs對(duì)E-Cadherin的調(diào)控探討芒柄花素抗過(guò)敏性疾病作用機(jī)制研究.pdf

1、在我國(guó)，隨著社會(huì)的不斷發(fā)展，過(guò)敏性疾病的發(fā)病率日漸增高。目前逐漸認(rèn)識(shí)到上皮細(xì)胞(Epthelial Cell，EC)在外界條件刺激下分泌的細(xì)胞因子胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(thymic stromal lymphopoietin，TSLP)和IL-33是關(guān)鍵的啟動(dòng)因子。）TLR(2、3、4、8、9)配體刺激呼吸道上皮細(xì)胞或皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞可顯著誘導(dǎo)TSLP mRNA的表達(dá)升高，同時(shí)上皮細(xì)胞間E-Cadherin蛋白表達(dá)的減少也會(huì)導(dǎo)致TSL

2、P表達(dá)的升高，那TLRs，E-Cadherin，過(guò)敏性疾病關(guān)鍵啟動(dòng)因子（TSLP和IL-33）之間是否有什么聯(lián)系？TLRs是否可能是通過(guò)調(diào)節(jié)E-Cadherin來(lái)影響TSLP和IL-33的分泌？此為本論文所要解決問(wèn)題之一。益氣固表方玉屏風(fēng)散在緩解期使用可以降低過(guò)敏性疾病的復(fù)發(fā)，但其中的效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制不明確。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，玉屏風(fēng)散含藥血清中芒柄花素的含量較高，并發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)初期給予芒柄花素可顯著減輕小鼠過(guò)敏性炎癥癥狀，這說(shuō)明

3、芒柄花素具有抗過(guò)敏的作用且作用在誘導(dǎo)初期。那芒柄花素是如何發(fā)揮作用的呢？其抗過(guò)敏的作用機(jī)制是什么？本文基于前期研究結(jié)果從以下幾個(gè)方面開(kāi)展研究:
　　1.TLRs對(duì)上皮細(xì)胞間E-Cadherin的調(diào)控及在過(guò)敏性疾病中可能的作用機(jī)制
　　(1)研究Toll樣受體(toll-like receptor，TLRs)對(duì)上皮細(xì)胞間E-Cadherin調(diào)控作用，這種調(diào)控作用是否可能會(huì)影響上皮細(xì)胞來(lái)源的關(guān)鍵促過(guò)敏因子TSLP以及IL-33的

4、分泌。通過(guò)加入TLR(2、3、4、8、9)的配體刺激16HBE24h后觀察上皮細(xì)胞間E-Cadherin的分布與表達(dá)，同時(shí)檢測(cè)上皮細(xì)胞來(lái)源的關(guān)鍵促過(guò)敏因子TSLP和IL-33蛋白以及基因的表達(dá)水平。
　　(2)確定其中影響上皮細(xì)胞間E-Cadherin的分布與表達(dá)的TLRs，對(duì)其作用機(jī)制深入研究。TLR3和TLR4的配體刺激誘發(fā)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，主要包括PI3K和MAPK/NF-κB信號(hào)途徑，MAPK/NF-κB信號(hào)途徑有三條并行

5、的信號(hào)通路，包括p38MAPK信號(hào)通路，ERK1/2信號(hào)通路以及JNK信號(hào)通路。加入ERK1/2抑制劑，p38MAPK抑制劑，JNK1/2/3抑制劑以及PI3K抑制劑，觀察上皮細(xì)胞在TLR4和TLR3配體刺激下E-cadheirn的表達(dá)。
　　2.TLRs對(duì)上皮細(xì)胞來(lái)源的過(guò)敏關(guān)鍵啟動(dòng)因子TSLP和IL-33蛋白以及基因水平的影響
　　(1)利用小鼠變應(yīng)性接觸性皮炎(Allergic Contact Dermatitis，AC

6、D)模型以及ACD復(fù)發(fā)模型，考察芒柄花素對(duì)過(guò)敏性炎癥的干預(yù)作用以及防復(fù)發(fā)的作用。BALB/c小鼠經(jīng)FITC致敏及激發(fā)形成ACD模型，并于該模型誘導(dǎo)初期給予芒柄花素，連續(xù)給藥至d3，于d7激發(fā)后24h測(cè)量小鼠雙耳厚度，計(jì)算耳腫脹度（右耳厚度-左耳厚度）并比較小鼠左右耳耳重變化，對(duì)激發(fā)后24h的耳組織進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。在小鼠ACD復(fù)發(fā)模型上，緩解期給予芒柄花素，給藥周期10天，于末次給藥結(jié)束后48h再次激發(fā)小鼠，量取小鼠耳厚，計(jì)算耳腫脹度

7、，觀察耳組織病理結(jié)構(gòu)改變，并檢測(cè)右耳組織勻漿中IL-4、IL-5、IL-9、IL-13表達(dá)水平。
　　(2)考察芒柄花素對(duì)上皮細(xì)胞來(lái)源的致敏關(guān)鍵啟動(dòng)因子TSLP和IL-33的影響。通過(guò)建立小鼠ACD誘導(dǎo)初期模型并在誘導(dǎo)初期給予芒柄花素，檢測(cè)小鼠的耳組織中TSLP和IL-33的蛋白以及基因表達(dá)水平。在體外用Poly(I∶C)以及LPS刺激支氣管上皮細(xì)胞16HBE，觀察芒柄花素對(duì)TSLP和IL-33表達(dá)的影響。
　　(3)觀察芒

8、柄花素對(duì)上皮細(xì)胞間E-Cadherin表達(dá)與分布的影響，來(lái)揭示芒柄花素調(diào)節(jié)關(guān)鍵促過(guò)敏因子TSLP和IL-33的表達(dá)是否可能與其調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞間E-Cadherin表達(dá)與分布有關(guān)。建立小鼠ACD誘導(dǎo)初期模型以及ACD復(fù)發(fā)模型并給予芒柄花素。透射電鏡觀察上皮細(xì)胞間的連接，同時(shí)檢測(cè)小鼠耳組織上皮細(xì)胞間E-Cadherin分布與表達(dá)。在體外，用TLRs的配體刺激支氣管上皮細(xì)胞16HBE，觀察芒柄花素對(duì)上皮細(xì)胞間E-Cadherin蛋白的調(diào)節(jié)作用。

9、
　　(4)考察芒柄花素對(duì)ACD致敏初期TLRs-NF-κB主要信號(hào)分子的影響以及對(duì)上皮細(xì)胞TLR3和TLR4蛋白以及下游信號(hào)分子蛋白表達(dá)，在體內(nèi)外揭示芒柄花素對(duì)上皮細(xì)胞間E-Cadheirn蛋白的表達(dá)以及分布的調(diào)控是否可能是通過(guò)調(diào)節(jié)TLRs以及其下游信號(hào)分子來(lái)發(fā)揮作用的。在小鼠ACD誘導(dǎo)初期模型給予芒柄花素，檢測(cè)小鼠耳組織中了TLRs-NF-κB主要信號(hào)分子的表達(dá)，觀察芒柄花素對(duì)TLRs-NF-κB主要信號(hào)分子的影響。體外用Po

10、ly(I∶C)與LPS刺激上皮細(xì)胞，檢測(cè)TLR3和TLR4蛋白以及下游信號(hào)分子蛋白表達(dá)。
　　研究結(jié)果:
　　(1)研究發(fā)現(xiàn)TLR3和TLR4激動(dòng)劑可使上皮細(xì)胞間E-Cadherin的分布發(fā)生紊亂，TLR3激動(dòng)劑可降低E-Cadherin的表達(dá)量。用LPS和Poly(I∶C)刺激上皮細(xì)胞發(fā)現(xiàn)TSLP和IL-33表達(dá)明顯升高，這提示LPS以及Poly(I∶C)可能通過(guò)激活TLR4和TLR3來(lái)破壞上皮細(xì)胞間E-Cadherin繼

11、而使TSLP和IL-33分泌增多。
　　(2)Poly(I∶C)刺激上皮細(xì)胞后加入p38MAPK，PI3K，ERK1/2和JNK1/2/3后均上調(diào)E-Cadherin的表達(dá)，其中p38MAPK抑制劑和PI3K抑制劑作用最為明顯，提示TLR3對(duì)上皮細(xì)胞間E-Cadherin的調(diào)節(jié)主要通過(guò)p38MAPK和PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。而在LPS的刺激下，加入四個(gè)抑制劑后細(xì)胞間E-Cadherin的表達(dá)與分布都明顯發(fā)生改善，提示TLR4對(duì)上皮細(xì)

12、胞間E-Cadherin的調(diào)節(jié)與p38MAPK、PI3K、ERK1/2以及JNK1/2/3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑均有關(guān)。
　　(3)芒柄花素僅在誘導(dǎo)初期給藥即能良好控制ACD小鼠的耳部炎癥，減輕耳腫脹，改善局部組織充血及炎細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變。在小鼠ACD復(fù)發(fā)模型上模擬臨床給藥方案即在緩解期給予芒柄花素，發(fā)現(xiàn)在緩解期連續(xù)10天給予芒柄花素，在第二次攻擊之前停藥48小時(shí)，測(cè)量小鼠耳腫脹度，芒柄花素可抑制小鼠耳腫脹度，降低耳厚減輕耳重，顯著減少耳

13、組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，減輕耳組織充血水腫，芒柄花素還能不同程度降低IL-4、IL-5、IL-13的表達(dá)水平。
　　(4)在小鼠ACD誘導(dǎo)初期模型誘導(dǎo)初期給予芒柄花素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與空白組相比，模型組小鼠的耳組織中TSLP和IL-33的蛋白以及基因水平顯著升高，而給予芒柄花素后能顯著降低TSLP以及IL-33的蛋白和基因表達(dá)水平。體外用Poly(I∶C)以及LPS刺激上皮細(xì)胞，觀察芒柄花素對(duì)TSLP和IL-33表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)芒柄花素可

14、抑制TSLP和IL-33的產(chǎn)生，進(jìn)一步證實(shí)芒柄花素誘導(dǎo)初期給藥即能抑制過(guò)敏性疾病與調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞來(lái)源的關(guān)鍵促過(guò)敏因子TSLP和IL-33的表達(dá)水平密切相關(guān)。
　　(5)在小鼠ACD誘導(dǎo)初期模型和ACD復(fù)發(fā)模型，發(fā)現(xiàn)小鼠經(jīng)FITC致敏和第二次攻擊后，上皮細(xì)胞間間隙明顯增大，細(xì)胞間連接疏松，E-Cadherin表達(dá)量顯著降低且分布發(fā)生紊亂，在致敏初期和緩解期給予芒柄花素后可使上皮細(xì)胞間E-Cadherin表達(dá)量以及紊亂現(xiàn)象得到改善。體外

15、結(jié)果顯示，上皮細(xì)胞在Poly(I∶C)和LPS的刺激下，細(xì)胞間E-Cadherin蛋白的分布發(fā)生明顯紊亂，而且Poly(I∶C)還會(huì)造成細(xì)胞間E-Cadherin蛋白量的改變，給予芒柄花素后，不僅使細(xì)胞間的E-Cadherin蛋白的分布得到一定的改善，還能上調(diào)Poly(I∶C)造成的細(xì)胞間E-Cadherin蛋白量下降。
　　(6)在小鼠ACD誘導(dǎo)初期模型檢測(cè)小鼠耳組織中TLRs-NF-κB主要信號(hào)分子的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白組相

16、比，模型組TLR2，TLR3，TLR4，TLR9，MYD88以及NF-κ3基因水平上升，給予芒柄花素后能下調(diào)TLR3，TLR4，TLR9，MYD88以及NF-κB基因的表達(dá)。16HBE細(xì)胞在Poly(I∶C)的刺激下，TLR3和TLR4下游的信號(hào)分子ERK1/2、p38MAPK、JNK和PI3K的磷酸化與空白組相比明顯增多，而加入芒柄花素后，可顯著下調(diào)TLR3下游信號(hào)分子PI3K的磷酸化以及TLR4下游信號(hào)分子ERK1/2和p38MAP

17、K的磷酸化，這提示芒柄花素可能是通過(guò)調(diào)節(jié)TLR3和TLR4影響其下游信號(hào)分子的激活，繼而改善上皮細(xì)胞間E-Cadherin的表達(dá)與分布。
　　結(jié)論:
　　(1)TLR3主要通過(guò)PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑影響上皮細(xì)胞間E-cadheirn蛋白的表達(dá)以及分布，并使促過(guò)敏關(guān)鍵細(xì)胞因子TSLP和IL-33分泌增多，繼而促進(jìn)Th2型過(guò)敏性疾病。而TLR4對(duì)上皮細(xì)胞間E-Cadherin的調(diào)控是通過(guò)p38MAPK、PI3K、ERK1/2以及J