人角質(zhì)形成細(xì)胞中TLR4對(duì)緊密連接蛋白的調(diào)控及Calycosin干預(yù)過敏性疾病機(jī)制探索.pdf

1、過敏性疾病的預(yù)防及治療是世界公認(rèn)的醫(yī)學(xué)難題，益氣固表方劑玉屏風(fēng)散臨床常用于防治過敏性疾病，并可有效減少疾病發(fā)作次數(shù)或減輕發(fā)作時(shí)癥狀，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)該方可影響TLRs相關(guān)信號(hào)分子，并改善上皮細(xì)胞連接蛋白的表達(dá)。那么TLRs與緊密連接蛋白是否存在調(diào)控關(guān)系是需要明確的問題。黃芪為玉屏風(fēng)散中的君藥，毛蕊異黃酮(Calycosin)為黃芪指標(biāo)性成分，通過前期研究我們發(fā)現(xiàn)Calycosin為玉屏風(fēng)散潛在效應(yīng)成分，能抑制小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)，且該抑

2、制效應(yīng)在遲發(fā)型超敏反應(yīng)的誘導(dǎo)階段即已出現(xiàn)，因此研究Calycosin對(duì)過敏性疾病的干預(yù)作用及作用機(jī)制能有助于闡釋玉屏風(fēng)散的效應(yīng)成分及對(duì)過敏性疾病的作用機(jī)理。本文結(jié)合部分前期研究結(jié)果從以下幾方面開展研究:
　　(1) TLRs對(duì)上皮細(xì)胞緊密連接蛋白的調(diào)控:利用TLRs配體刺激HaCaT細(xì)胞24h后，檢測(cè)上皮緊密連接(Tight Junction，TJ)主要成員ZO-1、Occludin的表達(dá)，同時(shí)檢測(cè)促炎因子TSLP、IL-33的表

3、達(dá)水平。同時(shí)對(duì)TLR4下游主要銜接蛋白及NF-κB信號(hào)的活化進(jìn)行考察，試圖找出TLRs調(diào)控上皮細(xì)胞屏障功能并釋放炎癥因子的主要機(jī)理。
　　(2) Calycosin對(duì)Th2型ACD作用及機(jī)制探索:利用小鼠變應(yīng)性接觸性皮炎（Allergic Contact Dermatitis，ACD）模型考察Calycosin對(duì)過敏性炎癥的干預(yù)作用。小鼠僅經(jīng)FITC溶液連續(xù)致敏2天以形成ACD模型的誘導(dǎo)初期，在該時(shí)期檢測(cè)TLR4及其下游關(guān)鍵銜接蛋

4、白的表達(dá)情況。電鏡下觀察小鼠耳部皮膚上皮細(xì)胞間連接情況，檢測(cè)上皮細(xì)胞緊密連接蛋白Occludin及ZO-1的表達(dá)水平、并考察促炎因子TSLP、IL-33的表達(dá)水平、NF-κB信號(hào)的活化，同時(shí)探究Calycosin對(duì)以上蛋白水平或基因水平的影響。
　　(3) Calycosin體外對(duì)Th2型ACD復(fù)發(fā)作用及機(jī)制初探:建立小鼠ACD復(fù)發(fā)模型考察Calycosin是否能減輕ACD復(fù)發(fā)時(shí)的炎性癥狀及可能作用機(jī)制。在緩解期給予Calycos

5、in，給藥周期10天，于末次給藥結(jié)束后24h再次激發(fā)小鼠，量取小鼠耳厚，計(jì)算耳腫脹，觀察耳組織病理結(jié)構(gòu)改變，檢測(cè)耳組織內(nèi)IL-4、IL-5、IL-9及IL-13水平。于緩解期考察Calycosin對(duì)Occludin、ZO-1、TLR4、MyD88、TIRAP、TAK1及NF-κB的影響。
　　(4) Calycosin對(duì)LPS誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞釋放關(guān)鍵炎癥啟動(dòng)因子機(jī)制探討:利用TLR4的配體LPS誘導(dǎo)人角質(zhì)形成細(xì)胞屏障功能缺失，同

6、時(shí)加入Calycosin進(jìn)行干預(yù)，試圖闡明Calycosin對(duì)TLR4調(diào)控上皮屏障的作用并對(duì)以上病理基礎(chǔ)進(jìn)行再次驗(yàn)證。利用LPS刺激HaCaT細(xì)胞24h后，檢測(cè)TLR4及下游銜接蛋白的表達(dá)、上皮細(xì)胞緊密連接蛋白Occludin及ZO-1的表達(dá)水平、并考察促炎因子TSLP、IL-33的表達(dá)水平、NF-κB信號(hào)的活化，同時(shí)探究Calycosin對(duì)以上蛋白水平或基因水平的影響。
　　研究結(jié)果:
　　(1)TLRs(2，3，4，8，

7、9)配體刺激人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT24h小時(shí)后，TLR4配體LPS顯著降低TJs主要成員ZO-1及Occludin的表達(dá)水平，TSLP和IL-33的表達(dá)較空白組明顯增多。進(jìn)一步研究表明，TLR4及其下游銜接蛋白的表達(dá)也呈上調(diào)趨勢(shì)，同時(shí)研究還顯示NF-κB信號(hào)的活化。加入NF-κB抑制劑后能夠逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的屏障缺失及促炎癥因子的釋放。以上結(jié)果提示，LPS對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT中TLR4進(jìn)行活化，活化的TLR4作用于下游信號(hào)關(guān)鍵蛋白

8、MyD88、TIRAP以及TAK1，隨后引起NF-κB的活化，活化的NF-κB介導(dǎo)了TJs失調(diào)并引起TSLP和IL-33的釋放。
　　(2)Calycosin能下調(diào)ACD誘導(dǎo)初期模型小鼠中TLR4及其下游MyD88、TIRAP和TAK1的表達(dá)，縮小耳部上皮組織因致敏導(dǎo)致的上皮細(xì)胞間間隙，并增加ZO-1及Occludin的表達(dá)水平。同時(shí)Calycosin能夠顯著減少小鼠耳組織中TSLP和IL-33蛋白及基因水平。同時(shí)，Calycos

9、in對(duì)炎癥信號(hào)NF-κB也具一定的抑制作用。綜上，在ACD誘導(dǎo)初期小鼠模型中TLR4-MyD88-TAK1蛋白表達(dá)水平高于空白組，表明TLRs信號(hào)通路處于活化狀態(tài)，而TLR4的高表達(dá)可能是其中重要的因素，而Calycosin能一定程度降低蛋白水平，提示Calycosin能抑制過敏性炎癥與TLR4-MyD88-TAK1介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)有關(guān)，這一結(jié)果與我們前期病理基礎(chǔ)也相一致。
　　(3)通過不同給藥方案比較Calycosin與地

10、塞米松等臨床常用抗過敏藥物效應(yīng)的不同，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在ACD復(fù)發(fā)模型緩解期給予小鼠藥物，給藥周期10天，于再次激發(fā)前24h停止給藥，僅Calycosin表現(xiàn)出對(duì)小鼠耳腫脹良好的干預(yù)作用，降低IL-4、IL-5、IL-9和IL-13等水平，而其他抗過敏藥未見明顯的抗復(fù)發(fā)作用。表明Calycosin通過調(diào)整病理狀態(tài)下的機(jī)體發(fā)生變化而發(fā)揮長(zhǎng)期效應(yīng)，而非僅短期內(nèi)控制炎性癥狀。在緩解期模型組連接蛋白ZO-1及Occludin較空白組蛋白呈下調(diào)趨勢(shì)，TL

11、R4-MyD88-TAK1及NF-κB蛋白表達(dá)水平高于空白組，表明TLR4信號(hào)通路處于活化狀態(tài)，與ACD誘導(dǎo)初期結(jié)果相似，Calycosin能一定程度降低TLR4蛋白水平，提示Calycosin能抑制ACD復(fù)發(fā)時(shí)過敏性炎癥可能與TLR4-MyD88-TAK1介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)有關(guān)。
　　(4)我們利用TLR4的配體LPS誘導(dǎo)人角質(zhì)形成細(xì)胞緊密連接蛋白異常表達(dá)，同時(shí)加入Calycosin進(jìn)行干預(yù)，試圖闡明Calycosin對(duì)TLR

12、4調(diào)控上皮緊密連接蛋白的作用并對(duì)以上病理基礎(chǔ)進(jìn)行再次驗(yàn)證。利用LPS刺激HaCaT細(xì)胞24h后結(jié)果顯示，經(jīng)LPS誘導(dǎo)后HaCaT細(xì)胞中TLR4的表達(dá)明顯增多。而給予不同劑量的Calycosin后，TLR4的表達(dá)水平明下降。隨后又對(duì)HaCaT細(xì)胞中TLR4下游主要銜接蛋白進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LPS誘導(dǎo)后細(xì)胞中MyD88、TIRAP和TAK1蛋白水平較空白組顯著上調(diào)，而給予不同濃度的Calycosin干預(yù)后，均能一定程度減少M(fèi)yD88、T

13、IRAP和TAK1的表達(dá)水平。經(jīng)LPS誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞后較空白組TJs蛋白水平顯著減少，給予Calycosin能不同程度上調(diào)Occludin和ZO-1的蛋白水平。免疫熒光結(jié)果表明，正常HaCaT細(xì)胞Occludin和ZO-1熒光較強(qiáng)，形成完整的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。經(jīng)LPS誘導(dǎo)后，HaCaT細(xì)胞間熒光減弱、Occludin和ZO-1表達(dá)下降。Calycosin干預(yù)后能逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的下調(diào)效應(yīng)。ELISA技術(shù)以及熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)TSLP和I

14、L-33含量結(jié)果表明，LPS組TSLP和IL-33的蛋白水平及其mRNA水平較空白組顯著升高。在此期間給予不同濃度的Calycosin均能在一定程度上降低TSLP和IL-33的蛋白水平及基因水平。給予Calycosin干預(yù)后NF-κB信號(hào)活化也明顯被抑制。以上結(jié)果提示，Calycosin可能會(huì)抑制NF-κB信號(hào)的活化，干擾與TLR4及下游相關(guān)蛋白的形成上調(diào)緊密連接蛋白的表達(dá)，進(jìn)而修復(fù)上皮屏障、減少促炎因子的釋放，達(dá)到治療和緩解過敏性疾病

15、的進(jìn)程。
　　結(jié)論:
　　(1) TLR4能夠?qū)Js表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，介導(dǎo)上皮緊密連接蛋白Occludin和ZO-1異常表達(dá)，并引起促過敏因子TSLP及IL-33的釋放。給予Calycosin干預(yù)后能夠明顯抑制TLR4及其下游的活化、并抑制NF-κB信號(hào)活化、促進(jìn)TJs的表達(dá)，進(jìn)而減少TSLP及IL-33釋放。
　　(2) Calycosin能夠抑制小鼠ACD模型及ACD復(fù)發(fā)中TLR4的表達(dá)，促進(jìn)TJs主要成員ZO-1和