TLR2在大鼠肝細胞EMT現(xiàn)象中的研究.pdf

1、研究背景與目的：肝纖維化和它的終末階段肝硬化在世界范圍威脅著人類健康。乙型、丙型病毒性肝炎、酒精性肝病及非酒精性肝病所引起的肝纖維化、肝硬化也相當常見。研究表明肝硬化是不可逆的，而肝纖維化是可逆的。因此，有效的抗纖維化治療就成了一個非常緊迫的問題。肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)的激活是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，也是目前研究的熱點。但是近3年的研究又認為肝細胞在肝纖維化中亦起到非常重要的作用。肝細胞約占肝臟

2、細胞總量的80％，數(shù)量最多，功能重要。肝細胞的炎癥壞死，肝細胞損傷，脂質(zhì)過氧化，凋亡等均在促使肝纖維化中起到重要作用。越來越多研究表明，除HS C在肝纖維化發(fā)生學中是主要的纖維源性細胞外，肝細胞也具有潛在的纖維源性[2]。并且研究認為肝細胞主要是通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化為成纖維細胞從而促使肝纖維化的形成。TLR作為主要的模式識別受體,在機體先天性免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用，并在肝臟疾病包括酒精性肝病、病毒性肝炎、肝纖維化等的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮

3、重要作用為此，本論文研究目的旨在揭示肝細胞EMT 現(xiàn)象中是否有TLR的調(diào)節(jié)作用，以深入闡明肝纖維化的發(fā)病機制，也為肝纖維化的早期干預(yù)提供新的思路。
　　 方法：
　　 一、肝細胞的分離與鑒定雄性Sprague-Darwley大鼠（150g-200g），分離門靜脈并插管，依次灌注膠原酶，37 ℃原位消化，3次4 ℃水平離心得到肝細胞，于含10％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12中培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)液。臺盼藍染色鑒定細胞存

4、活率。顯微鏡下觀察死亡與正常的肝細胞,鑒定肝細胞成活率。
　　 二、 TGF-β刺激肝細胞產(chǎn)生EMT 現(xiàn)象當細胞生長基本貼滿皿底時，以含10％胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)液中加入TGF-β(5 ng/mL)作用48 h后，使用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)學的改變并拍照。以不加TGF-β組作為對照組。提取細胞總RNA，PCR 檢測E-cad、 vimentin的mRNA表達。
　　 三、TLR2在肝細胞EMT 現(xiàn)象中的表

5、達普通PCR 檢測E-cad、 vim entin的mRN A表達后，再檢測TLR2 mRNA的表達。四、統(tǒng)計學分析數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準誤表示，數(shù)據(jù)由SPSS 13.0軟件統(tǒng)計包處理。兩組之間比較用t 檢驗，相關(guān)性比較用線性相關(guān)，多組間的比較用One-Way ANOV A 方差分析：方差齊性用LSD 方法比較；方差不齊用Dunnett’s 方法比較。P<0.05 認為有統(tǒng)計學差異。
　　 結(jié)果：一、肝細胞鑒定臺盼藍染色鑒定肝細胞存活

6、率95％以上，能滿足實驗要求。二、TGF-β刺激肝細胞產(chǎn)生EMT 現(xiàn)象（一）TGF-β刺激肝細胞對細胞形態(tài)的影響TGF-β刺激48小時的肝細胞細胞形態(tài)由平鋪彌漫的島狀細胞變成紡錘形間隙較大的細胞。細胞逐漸分離。（二）TGF-beta對肝細胞EMT 現(xiàn)象相關(guān)指標mRNA的影響TGF-β刺激48小時的肝細胞的E-cad mRNA表達明顯低于不加刺激的正常HC的表達（P<0.05）。而TGF-β刺激48小時的肝細胞的vi menTin mRN

7、 A表達明顯高于不加刺激的正常肝細胞的表達（P<0.05）。三、TLR2在肝細胞EMT 現(xiàn)象中的表達TGF-β刺激48小時的肝細胞的TLR2 mRNA與蛋白水平的表達明顯高于不加刺激的正常HC的表達（P<0.05）。
　　 結(jié)論：一、TGF-β刺激肝細胞可引起肝細胞形態(tài)學的變化，E-cad m RNA水平表達下降，v I m entin mRNA水平表達上升。提示TGF-β可以促使肝細胞產(chǎn)生EMT 現(xiàn)象。二、 TGF-β刺激肝細