TLR2與TNFR1在骨髓炎發(fā)展過(guò)程中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、骨髓炎(Osteomyelitis)是一種由骨感染引起的骨科疾病，骨感染可累及骨皮質(zhì)、骨髓、骨膜以及周?chē)浗M織。從發(fā)病原因看，骨髓炎可繼發(fā)于開(kāi)放性骨折、內(nèi)固定手術(shù)及關(guān)節(jié)置換術(shù)后感染的細(xì)菌污染，也可以如糖尿病患者因足部缺血，軟組織壞死導(dǎo)致細(xì)菌從壞死部位侵入感染骨組織，而血源性骨髓炎多發(fā)生于兒童及老年人等免疫力低下的人群。
　　能引起骨髓炎的致病菌很多，但目前最為常見(jiàn)的致病菌是革蘭氏陽(yáng)性金黃色葡萄球菌。金黃色葡萄球菌通過(guò)其粘附特性對(duì)骨

2、組織進(jìn)行感染，而骨細(xì)胞外基質(zhì)富含蛋白質(zhì)，如纖連蛋白、膠原蛋白和骨唾液酸蛋白，也為金黃色葡萄球菌的粘附提供了良好的生存環(huán)境。在感染過(guò)程中，形成的生物膜可以使細(xì)菌躲避機(jī)體免疫系統(tǒng)和抵抗抗生素的殺滅作用，同時(shí)病灶局部的血供差也使得藥物對(duì)病原菌的清除變得極為困難。因此，時(shí)至今日對(duì)骨髓炎的治療還依然是擺在骨科醫(yī)生面前的一個(gè)難題。
　　動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是目前研究骨髓炎發(fā)病機(jī)理、診斷和治療的一個(gè)主要手段。設(shè)計(jì)出合理有針對(duì)性的動(dòng)物模型對(duì)骨髓炎的研究是非常

3、重要的。目前已知骨髓炎骨組織的病理變化主要表現(xiàn)為骨質(zhì)破壞和骨缺損，已知這種骨性結(jié)構(gòu)的病理改變與疾病引起骨重塑過(guò)程中成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞之間動(dòng)態(tài)平衡的改變有關(guān)，盡管某些生物學(xué)活性因子如調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞活性和功能的炎癥因子已經(jīng)被前人研究鑒定，金黃色葡萄球菌對(duì)骨重塑的影響機(jī)制及相關(guān)作用因子并不清楚。在骨髓炎的病理發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，組織損傷往往伴隨著骨細(xì)胞死亡，而骨細(xì)胞死亡是骨重塑過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)。TLRs被認(rèn)為是負(fù)責(zé)偵測(cè)侵襲微生物的固有免疫系統(tǒng)成分，

4、其對(duì)于宿主識(shí)別微生物的生物學(xué)成分來(lái)說(shuō)必不可少，尤其是對(duì)于革蘭陽(yáng)性菌的脂蛋白/脂肽類(lèi)、肽聚糖和脂磷壁酸的識(shí)別。TNFR1的主要生理學(xué)功能是通過(guò)刺激B細(xì)胞來(lái)誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生和急性炎癥免疫反應(yīng)。它與SpA相結(jié)合可激活NF-κB，促進(jìn)能在抗原特異性免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)中起重要作用的IL-6的表達(dá)。本研究將詳細(xì)探討TLR2與TNFR1在骨骼感染金黃色葡萄球菌后相關(guān)因子的表達(dá)及信號(hào)通路的變化，以及二者之間的相互影響作用，以進(jìn)一步明確骨髓炎發(fā)病機(jī)制及病理變

5、化特點(diǎn)。
　　目的：
　　研究在金黃色葡萄球菌感染的成骨細(xì)胞中TNFR1與TLR2之間的相互作用關(guān)系，及對(duì)金黃色葡萄球菌侵襲力的影響，為臨床上治療骨髓炎提供新的方法及潛在藥物作用靶點(diǎn)。
　　通過(guò)細(xì)菌緩釋的方法，建立大鼠脛骨近端的骨髓炎模型，為研究骨髓炎提供可信、可靠的動(dòng)物模型。
　　局部注射JNK信號(hào)通路抑制劑(SP600125)，觀察骨髓炎的病理學(xué)改變，為下一步本研究應(yīng)用于臨床提供可靠的依據(jù)。
　　方法：

6、
　　通過(guò)AnnexinⅤ-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，通過(guò)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)及免疫印跡(western blotting)評(píng)估TLR2及凋亡相關(guān)蛋白及絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平，通過(guò)堿性磷酸酶試劑盒及茜素紅染色檢測(cè)堿性磷酸酶(ALP)活性及鈣鹽沉積水平。通過(guò)沉默TNFR-1表達(dá)觀察JNK信號(hào)通路及TLR2的改變，并且觀察感染恢復(fù)的情況。
　　采

7、用細(xì)菌濃度為1×105CFU的金黃色葡萄球菌菌液與海藻酸鈉及殼聚糖溶液用兩步注射液滴法制成包裹金黃色葡萄球菌的殼聚糖-海藻酸鈉復(fù)合微球，直徑約1 mm。術(shù)中在大鼠脛骨近端開(kāi)鉆一直徑1mm骨孔，將細(xì)菌緩釋微球置入大鼠骨髓腔中，進(jìn)行細(xì)菌緩釋誘導(dǎo)骨髓炎模型的形成。術(shù)后采用大體觀察、分泌物培養(yǎng)及組織病理學(xué)等檢查進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　將25μ M的JNK信號(hào)通路抑制劑(SP600125)注射于大鼠骨髓炎感染的局部病灶中，HE染色觀察其病理學(xué)改變。

8、
　　結(jié)果：
　　1、金黃色葡萄球菌以時(shí)間依賴(lài)的方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，上調(diào)TLR2表達(dá)并激活絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路。抑制c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號(hào)通路可下調(diào)TLR2表達(dá)并抑制金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的促凋亡信號(hào)通路活化。短發(fā)夾RNA介導(dǎo)的TLR2基因沉默可逆轉(zhuǎn)金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、ALP活性降低并鈣質(zhì)沉積減少，JNK信號(hào)通路的抑制具有相似的效應(yīng)。隨著感染的金黃色葡萄球菌濃度的增加，細(xì)胞的生存能力開(kāi)始下降并出現(xiàn)死亡

9、，表達(dá)TLR2，同時(shí)炎性因子(TNF-a and IL-6)的分泌增加。c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號(hào)通路在金黃色葡萄球菌的感染過(guò)程中亦被激活。沉默TNFR1表達(dá)可以抑制金黃色葡萄球菌感染細(xì)胞中的JNK信號(hào)通路和降低TLR2蛋白水平，進(jìn)而減少炎性因子(TNF-a and IL-6)的分泌。沉默TNFR1同樣可以減少感染了金黃色葡萄球菌細(xì)胞中的破骨細(xì)胞分化因子(RANKL)水平。
　　2、造模過(guò)程中出現(xiàn)2例大鼠在術(shù)后1天內(nèi)死亡

10、，其余大鼠在術(shù)后均可見(jiàn)到術(shù)區(qū)傷口化膿，竇道形成，分泌物培養(yǎng)為金黃色葡萄球菌陽(yáng)性，組織學(xué)檢查證實(shí)為骨髓炎。經(jīng)多方面評(píng)價(jià)證實(shí)了大鼠的骨髓炎模型建立成功（16例大鼠）。
　　3、HE染色結(jié)果顯示局部注射JNK通路抑制劑(SP600125)處理的大鼠，病灶處依舊存在病變組織，但與治療前對(duì)比得到明顯改善。
　　結(jié)論：
　　TNFR1基因沉默可部分抑制金黃色葡萄球菌感染引起的TLR2表達(dá)增加，而TLR2阻斷抗體可完全阻斷金黃色葡萄

11、球菌對(duì)TLR2表達(dá)的影響。TLR2阻斷抗體抑制TNF-α和IL-6表達(dá)，但并不能降低至感染前水平，再一次說(shuō)明在此過(guò)程中存在其它的信號(hào)通路作用。JNK通路的抑制劑可減少TNF-α、IL-6及TLR2表達(dá)，但也不能降低至感染前水平?？偟膩?lái)說(shuō)，本部分研究中我們發(fā)現(xiàn)在金黃色葡萄球菌引起的細(xì)胞反應(yīng)中，TLR2和TNFR1密切相關(guān)，并且對(duì)金黃色葡萄球菌感染有調(diào)節(jié)作用。
　　細(xì)菌緩釋方法能夠有效模擬開(kāi)放性骨折低毒性細(xì)菌持續(xù)感染局部骨組織，是建立