Anti-Β2gpi-β2GPI復合物對THP-1細胞的激活作用及其信號轉(zhuǎn)導通路的研究.pdf

1、目的：本課題組前期工作表明，抗磷脂抗體/抗原復合物(anti-β2GPI/β2GPI)能夠刺激血液單核細胞及單核細胞株THP-1表達TF，成為抗磷脂綜合征(APS)血栓形成的機制之一。Toll樣受體4(TLR4)及膜聯(lián)蛋白Ⅱ(ANX2)作為受體介導了上述過程。本論文重點探討anti-β2GPI/β2GPI復合物能否激活THP-1細胞，促進炎性相關(guān)因子IL-6、IL-8及TNF-α表達，從而參與APS的病理過程，并探討其信號轉(zhuǎn)導途徑是否與

2、TLR4相關(guān)，進一步確定TLR4與ANX2、β2GPI的關(guān)系。
　　 方法：①利用熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測anti-β2GPI/β2GPI誘導THP-1細胞TF mRNA及IL-6、IL-8、TNF-α mRNA的表達，采用免疫熒光法觀察IL-6、IL-8及TNF-α蛋白分泌情況，并觀察其時效關(guān)系。采用試劑盒檢測細胞TF活性。②利用自制的β2GPI膠聯(lián)親和層析柱(β2GPI-Affi-Gel)分析β2GP

3、I與THP-1細胞表面相應受體(TLR4、ANX2)結(jié)合情況。③Real-time PCR、Western蛋白印跡檢測anti-β2GPI/β2GPI復合物誘導細胞表達TLR4、MyD88(髓樣分化因子88)、MD-2(髓樣分化蛋白-2)情況。④采用TLR4特異性拮抗劑TAK242、MD-2拮抗劑紫杉醇觀察是否干預anti-β2GPI/β2GPI復合物激活細胞，抑制促炎因子IL-6、IL-8及TNF-α的表達。
　　 結(jié)果：①A

4、nti-β2GPI/β2GPI復合物(100μg/ml)顯著增加THP-1細胞TF mRNA水平及TF活性(與對照比較p＜0.01)；并刺激細胞IL-6、IL-8及TNF-α mRNA的表達，刺激效應顯示時間依賴性，于刺激2 h時達到高峰(p＜0.01 vs control)；細胞表達IL-6、IL-8及TNF-α蛋白水平也隨刺激時間明顯增加。②THP-1細胞表面的TLR4及ANX2能夠結(jié)合于β2GPI-Affi-Gel柱，從而被洗脫下

5、來。③Anti-β2GPI/β2GPI復合物(100μg/ml)刺激THP-1細胞表達TLR4、MyD88、MD-2明顯升高(與對照比較p＜0.01)。④TAK242(5μM/L)、紫杉醇(1μmol/L)能夠拮抗anti-β2GPI/β2GPI復合物對細胞的刺激效應，降低細胞促炎因子IL-6、IL-8及TNF-α的表達(與無拮抗劑比較p＜0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1.Anti-β2GPI/β2GPI復合物不僅刺

6、激人單核細胞株THP-1細胞表達TF、還增加炎性因子IL-6、IL-8、TNF-α的表達，提示aPL也可通過上調(diào)炎性因子的表達參與APS的病理機制。
　　 2.TLR4與ANX2作為β2GPI的共受體，介導anti-β2GPI/β2GPI復合物激活THP-1細胞的信號轉(zhuǎn)導。
　　 3.Anti-β2GPI/β2GPI復合物激活THP-1細胞表達TF及IL-6、IL-8、TNF-α過程中，TLR4及其接頭蛋白MyD88、M