Cbp分子在CD59 GPI介導的T細胞抑制信號轉(zhuǎn)導中的作用研究.pdf

1、目的:研究GPI錨固蛋白CD59與Cbp在細胞上的定位及在T細胞信號轉(zhuǎn)導通路中的相互作用，以探討CD59向T細胞內(nèi)傳遞信號的相關(guān)機制。
　　 方法:應用細胞免疫熒光技術(shù)，通過激光共聚焦熒光顯微鏡系統(tǒng)對CD59、Cbp的定位進行了分析。利用RNA干擾技術(shù)，設計針對Cbp基因的寡核苷酸序列，克隆至線性化的pSUPER載體中構(gòu)建pSUPER-siCbp重組質(zhì)粒并進行鑒定。采用電轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染Jurkat細胞，熒光顯微鏡觀察GFP基因表達

2、，并行RT-PCR和western blot檢測轉(zhuǎn)染細胞中Cbp的表達。將pSUPER-siCbp、pEGFP-N3-Cbp、突變型pEGFP-N3-Cbp三種質(zhì)粒進行擴增并酶切鑒定，同樣轉(zhuǎn)染Jurkat細胞，檢測各轉(zhuǎn)染組Cbp蛋白的表達。CD59mAb交聯(lián)刺激細胞后，western blot檢測各組Csk、p-ZAP-70和p-Fyn表達量;MTT檢測細胞增殖;ELISA檢測細胞上清中白介素2（IL-2）的水平。
　　 結(jié)果:

3、激光共聚焦結(jié)果顯示:細胞靜止時，Cbp分子點狀聚集于膜上，CD59分子廣泛分布;隨著細胞活化，Cbp少量的散在分布，而CD59表達增多并點狀聚集。pSUPER-siCbp重組質(zhì)粒經(jīng)菌液PCR、DNA PCR、限制性內(nèi)切酶雙酶切分析和DNA測序鑒定正確。各轉(zhuǎn)染組可表達綠色熒光蛋白，轉(zhuǎn)染J2-pSUPER-siCbp重組質(zhì)粒的Jurkat細胞中Cbp基因表達量明顯低下其他各組。選取J2組質(zhì)粒進行后續(xù)檢測結(jié)果:與未轉(zhuǎn)染組比較，在基因與蛋白水平

4、，干擾組Cbp表達減少，而高表達組和突變組Cbp表達增加。CD59mAb交聯(lián)刺激細胞后，與未轉(zhuǎn)染組比較，干擾組和突變組細胞增殖快，IL-2分泌增多，Csk、p-ZAP-70和p-Fyn增多，突變組變化更明顯;高表達組細胞則與之相反。
　　 結(jié)論:CD59可借助棕櫚酰基團使Cbp分子磷酸化，向細胞內(nèi)傳遞抑制信號，引起細胞內(nèi)相關(guān)分子的一系列變化，為探討CD59與Cbp在T細胞信號轉(zhuǎn)導通路中相互作用及CD59 GPI胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導機制奠