跨膜銜接蛋白CBP及其棕櫚?；稽c(diǎn)突變?cè)贑D59介導(dǎo)的T系白血病中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究.pdf

1、目的：探討跨膜銜接蛋白CBP與GPI錨固蛋白CD59在T細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用，進(jìn)一步研究CBP與CD59在信號(hào)傳遞中的相互關(guān)系及作用機(jī)制，為白血病的治療方面提供了相關(guān)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：選取Jurkat細(xì)胞系作為研究對(duì)象，構(gòu)建CBP-EGFP慢病毒載體和CBP棕櫚?；稽c(diǎn)突變-EGFP慢病毒載體，建立了穩(wěn)定表達(dá)CBP-EGFP/CBP-M-EGFP的細(xì)胞系。使用CD59單克隆抗體分別刺激各組細(xì)胞，采用免疫熒光化學(xué)技術(shù)檢測(cè)C

2、BP、CD59在細(xì)胞上的表達(dá)及定位關(guān)系；光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞的基礎(chǔ)生長(zhǎng)狀態(tài)；電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的復(fù)雜程度及超微結(jié)構(gòu)的變化。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的基本參數(shù)及凋亡情況；CCK8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖效率。Western Blot檢測(cè)與CBP結(jié)合的抑制性酪氨酸激酶CSK以及TCR活化通路中重要的信號(hào)分子LCK、FYN、PLCG1及ZAP70的表達(dá)。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)了轉(zhuǎn)染后CBP基因的表達(dá)情況，同時(shí)檢測(cè)了T細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中重要信號(hào)分子CD59、C

3、SK、LCK、PLCG1及GRB2的表達(dá)。
　　結(jié)果：①激光共聚焦結(jié)果顯示：共聚焦顯微鏡可見(jiàn)CBP、CD59分子定位于細(xì)胞膜上；CD59抗體交聯(lián)刺激后，CBP-EGFP組可見(jiàn)CBP分子和CD59分子均呈戒指環(huán)狀或點(diǎn)簇狀高亮熒光分布，且分布區(qū)域存在交叉重疊，而CBP-M-EGFP組CBP分子與CD59分子在部分細(xì)胞中均出現(xiàn)點(diǎn)簇狀聚集現(xiàn)象，但兩者并不重疊。②光鏡下發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染CBP-EGFP病毒的Jurkat細(xì)胞皺縮細(xì)胞增多，大小均一性較

4、差，以小個(gè)頭細(xì)胞為主，CBP-M-EGFP組細(xì)胞形態(tài)大小不一，但以大個(gè)頭細(xì)胞多見(jiàn)。③電鏡可見(jiàn)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器較Jurkat細(xì)胞復(fù)雜，有兩組均出現(xiàn)自噬體樣團(tuán)塊，但CBP-EGFP組較多，同時(shí)核質(zhì)比降低、胞核變小、不規(guī)則，部分細(xì)胞器有腫脹現(xiàn)象。④實(shí)時(shí)定量PCR顯示，轉(zhuǎn)染病毒后，CBP基因在CBP-EGFP組和CBP-M-EGFP組的表達(dá)均上調(diào)。與CBP結(jié)合的抑制性酪氨酸激酶CSK基因表達(dá)量在CBP-EGFP組上調(diào)，在CBP-M-EGFP組

5、是下調(diào)的。CD59、CSK、LCK、PLCG1及GRB2在CBP-EGFP組是下調(diào)的，而在CBP-M-EGFP組的結(jié)果則是相反的。⑤Western Blot顯示,與CBP結(jié)合的抑制性蛋白CSK的表達(dá)量是增加的，CD59單抗作用以后CSK的表達(dá)量進(jìn)一步增加；在CBP-EGFP組TCR活化通路中蛋白LCK、FYN、ZAP70表達(dá)量均下降，而CBP-M-EGFP組則是上升的。⑥CCK8結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染CBP-EGFP病毒載體后，細(xì)胞的活性和增殖

6、效率明顯下降；而轉(zhuǎn)染突變了棕櫚?；稽c(diǎn)的病毒載體，細(xì)胞活性增加，增殖效率上升。⑦細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，CBP-EGFP組中，主要為早期凋亡細(xì)胞，比例為40％左右，中晚期凋亡細(xì)胞的比例在15%左右，CBP-M-EGFP組中，早期凋亡細(xì)胞和中晚期凋亡細(xì)胞均存在，早期凋亡細(xì)胞比例為25%左右，中晚期凋亡細(xì)胞比例為12%左右；CD59抗體交聯(lián)后，CBP-EGFP組細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯增加，隨著交聯(lián)時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡數(shù)目逐漸增加，CBP-M-EGFP組隨著

7、交聯(lián)時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡數(shù)目逐漸減少。
　　結(jié)論：高表達(dá)CBP能有效抑制Jurkat細(xì)胞的增殖，突變CBP棕櫚?；稽c(diǎn)后抑制效果明顯下降，同時(shí)利用CD59抗體交聯(lián)，證實(shí)CD59可借助棕櫚?；鶊F(tuán)使CBP分子磷酸化,向細(xì)胞內(nèi)傳遞抑制信號(hào)，引起TCR活化通路中一系列相關(guān)分子的變化，為探討CD59與CBP在T細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中相互作用奠定了基礎(chǔ),為探索T系淋巴細(xì)胞白血病發(fā)病機(jī)制提供了一定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，同時(shí)也為臨床 T系白血病的診斷、防治提供了新