人CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及其在兒童急性白血病中的研究.pdf

1、人類天然CD4<'+>CD25<'+>調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(nTreg)起源于胸腺，由遺傳控制，受抗原識(shí)別和多種信號(hào)的影響，尤其是細(xì)胞因子如IL-2、TGF-B等控制著它們的活化、擴(kuò)增和抑制功能。其發(fā)育可能經(jīng)歷了兩個(gè)連續(xù)的過程，即在胸腺中啟動(dòng)調(diào)節(jié)表型，獲得抑制活性，在外周的淋巴器官進(jìn)一步活化。人nTreg細(xì)胞約占外周血CD4<'+>細(xì)胞的5-10％，除組成性地表達(dá)IL-2受體α鏈(CD25)和CTIA-4(CD152)外，還表達(dá)GITR、CD6

2、2L 等。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，forkhead box p3基因編碼的一種核蛋白——FoxP3調(diào)控著CD4<'+>CD25<'+>T細(xì)胞的發(fā)育和抑制功能，是Treg細(xì)胞更為特異的標(biāo)記物。 Treg具有免疫無能性和免疫抑制性兩大特點(diǎn)，即在各種刺激下不發(fā)生增殖，也不分泌IL-2、IFN-γ，但經(jīng)TCR激活后，能夠抑制CD4<'+>CD25<'->效應(yīng)性T細(xì)胞(T-resp)和CD8<'+>T細(xì)胞的增殖及其細(xì)胞因子的產(chǎn)生，抑制T-resp

3、、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)和自然殺傷細(xì)胞(NK)的抗腫瘤免疫反應(yīng)，因此Treg細(xì)胞在介導(dǎo)對(duì)自身抗原的耐受、抗移植排斥反應(yīng)和抑制腫瘤的免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要的作用。 目的 (1)探討人CD4<'+>CD25<'+>調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的檢測(cè)條件、方法，建立不同年齡正常人群的參考值范圍，分析其分布規(guī)律；(2)檢測(cè)臍血和新生兒外周血CD4<'+>CD25<'+>T細(xì)胞的表型特征，探討其在母體內(nèi)和臍血干細(xì)胞移植中發(fā)揮的作用；(3)體

4、外分離CD4<'+>CD25<'+>T細(xì)胞，檢測(cè)其表型特征，并進(jìn)行體外擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)和功能測(cè)定。(4)檢測(cè)不同治療階段急性淋巴細(xì)胞性白血病患兒外周血的Treg，探討其在兒童ALL發(fā)生、治療過程中所處的地位和意義。 方法 (1)采用雙色或三色直接免疫熒光素法標(biāo)記細(xì)胞抗原，包括細(xì)胞膜表面、胞漿和胞核抗原，如：CD4、CD25、CD62L、CD45RA、CD45RO、CDl52、FoxP3等，多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)；(2)應(yīng)用MACS

5、和FACS分選CD4<'+>CD25<'+>、CD4<'+>CD25<'->T細(xì)胞，F(xiàn)ACS測(cè)定細(xì)胞純度；(3)分別培養(yǎng)分選純化后的淋巴細(xì)胞，觀察CD4<'+>CD25<'+>T細(xì)胞在抗CD3單抗、抗CD28單抗的刺激并有高濃度IL-2存在的情況下能否增殖；(4)進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)，比色法測(cè)定CD4<'+>CD25<'+>T細(xì)胞的抑制功能。 結(jié)果 (1)標(biāo)本分別在室溫下放置0h、1h、2h、3h、4h、5h和6h檢測(cè)時(shí)

6、，CD4<'+>CD25<'hi>T細(xì)胞分別為(1.41±0.26)％、(1.45±0.26)％、(1.32±0.26)％、(1.27±0.28)％、(1.09±0.24)％、(0.95±0.18)％、(0.91±0.21)％。結(jié)合細(xì)胞分布特點(diǎn)，將CD25的MFI約是CD4<'+>CD25<'+>細(xì)胞2倍的亞細(xì)胞群定為CD4<'+>CD25<'hi>T細(xì)胞，85％以上的CD4<'+>CD25<'hi>表達(dá)FoxP3。(2)4-6歲組、7

7、-14歲組、20-59歲組、60歲以上組健康人群CD4<'+>CD25<'hi>參考值分別是(0.92±0.30)％、(1.21±0.45)％、(1.44±0.52)％及(1.5 1±0.55)％。(3)臍血及新生兒外周血CD4<'+>CD25<'+>T細(xì)胞呈熒光強(qiáng)度比較均勻一致的獨(dú)立細(xì)胞群，且以CD45RA+亞型為主，成人的Treg則主要是CD45RO+細(xì)胞。(4)經(jīng)300U/mL的IL-2和抗CD3、抗CD28單抗刺激后12天，Tr

8、eg細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)增了約1300倍；在混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)中，新鮮分選的CD4<'+>CD25<'+>T細(xì)胞可抑制約50％的CD4<'+>CD25<'->T細(xì)胞增殖。(5)標(biāo)危組治療不同階段的ALL兒童CD4<'+>CD25<'hi>數(shù)值分別為：首次誘導(dǎo)完全緩解組(1.04±0.33)％，3年以上持續(xù)完全緩解組(1.29±0.30)％，維持治療組(1.60±0.44)％；中/高危維持治療組為(2.24±0.75)％。 結(jié)論 (1

9、)明確了檢測(cè)人Treg的最佳條件(即標(biāo)本應(yīng)在3h內(nèi)檢測(cè))和分析方法，通過FoxP3表達(dá)特征及功能實(shí)驗(yàn)證明CD4<'+>CD25<'hi>更能特異性代表和反應(yīng)Treg細(xì)胞的水平。(2)建立不同年齡段正常人CD4<'+>CD25h<'hi>T細(xì)胞的參考值范圍，并發(fā)現(xiàn)隨年齡變化人Treg也呈現(xiàn)規(guī)律性改變。(3)臍血及新生兒外周血CD4<'+>CD25<'+>T細(xì)胞有獨(dú)特的表型特征，數(shù)量較高且功能完好。(4)在特定的培養(yǎng)條件下，Treg細(xì)胞可以