再生障礙性貧血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞缺陷的研究.pdf

1、背景：
　　 再生障礙性貧血（aplastic anemia,AA）是一種自身反應(yīng)性T淋巴細胞攻擊靶器官骨髓所致的骨髓衰竭性疾病。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞(Tregs)可通過抑制自身反應(yīng)性T淋巴細胞進而控制自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展。CD4+CD25+Tregs缺陷致其抑制自身反應(yīng)性T淋巴細胞增殖及分泌細胞因子的能力下降，進而導致自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展，已有研究證實其在多種自身免疫性疾病中存在缺陷，但其在AA發(fā)病機制中的作

2、用尚未明確。
　　 目的：
　　 本研究旨在檢測AA患者CD4+CD25+Tregs數(shù)量是否減少、功能是否缺陷，探討其在AA發(fā)病機制中的作用，為AA的免疫抑制治療提供新的方向。
　　 方法：
　　 (1)采用Ficoll密度梯度離心法分離外周血和骨髓單個核細胞（PB/BMMNC）；
　　 (2)流式細胞術(shù)檢測PB與BMCD4+CD25+Tregs比率；
　　 (3)免疫磁珠分選法(MACS

3、)分選CD4+CD25+Tregs，CD4+CD25-反應(yīng)性T細胞(Tresp)和CD8+細胞毒性T細胞(Tcyt)；
　　 (4)采用Transwell檢測CD4+CD25+Tregs遷移能力；
　　 (5)Real-time PCR方法檢測PB和BMCD4+CD25+Tregs上CXCR4和CXCR7 mRNA表達水平；
　　 (6)流式細胞術(shù)(FACS)檢測PBCD4+CD25+Tregs上CXCR4表達水

4、平；
　　 (7)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測血清與骨髓上清中SDF-1α水平；
　　 (8)建立Tregs與自身Tresp或Tcyt共培養(yǎng)體系，用Brdu ELISA kit檢測Tresp和Tcyt增殖情況以及Tregs對Tresp或Tcyt增殖抑制能力；
　　 (9)建立AA患者Tregs與正常對照Tresp或Tcyt以及正常對照Tregs與AA患者Tresp或Tcyt的交叉培養(yǎng)體系，檢測AA患者Treg

5、s本身是否存在缺陷；
　　 (10)ELISA方法檢測體外共培養(yǎng)上清IFN-γ；
　　 (11)MACS分選臍血來源CD34+細胞，通過甲基纖維素半固體培養(yǎng)基(H4434)中加入體外共培養(yǎng)體系獲得的上清，比較AA患者和正常對照Tregs改善造血克隆形成的能力。
　　 結(jié)果：
　　 (1)AA患者PB和BMCD4+CD25+Tregs比率均低于正常對照組；
　　 (2)AA患者PBCD4+CD25+

6、Tregs遷移能力低于正常對照組，且與疾病嚴重程度密切相關(guān)；
　　 (3)AA患者PB和BMCD4+CD25+Tregs CXCR4基因水平的表達均低于正常對照組，而CXCR7基因水平無顯著差異；
　　 (4)AA患者PBCD4+CD25+Tregs CXCR4蛋白水平的表達低于正常對照組；
　　 (5)AA患者血清與骨髓上清中SDF-1α的水平與正常對照組無顯著差異；
　　 (6)AA患者骨髓上清與正常

7、對照組相比，對PBCD4+CD25+Tregs的趨化能力無顯著差異；
　　 (7)AA患者PB和BM Tresp或Tcyt增殖能力均較正常對照組顯著增強；
　　 (8)AA患者PB和BM Tregs抑制自身Tresp或Tcyt增殖能力較正常對照組顯著降低；
　　 (9)正常對照PB Tregs可抑制AA患者PB Tresp或Tcyt增殖，而AA患者Tregs抑制Tresp或Tcyt增殖能力顯著下降；
　　

8、 (10)AA患者PB和BM Tresp或Tcyt產(chǎn)生IFN-γ的能力顯著高于正常對照組；
　　 (11)AA患者PB和BM Tregs抑制Tresp或Tcyt產(chǎn)生IFN-γ的能力顯著低于正常對照組；
　　 (12)AA患者Tresp或Tcyt體外培養(yǎng)上清可明顯抑制造血克隆形成；
　　 (13)AA患者Tregs改善造血克隆形成能力顯著低于正常對照組。
　　 結(jié)論：
　　 (1)AA患者CD4+C