人CD59基因活性位點(diǎn)突變對(duì)腫瘤逃逸相關(guān)分子補(bǔ)體及caspase-3的作用研究.pdf

1、目的:構(gòu)建兩種人CD59基因突變的重組體pALTER-MAX-CD59，轉(zhuǎn)染入HeLa細(xì)胞，篩選高表達(dá)人突變CD59的陽性細(xì)胞克隆，檢測(cè)HeLa細(xì)胞中突變CD59對(duì)腫瘤逃逸相關(guān)分子(caspase-3)的抑制效應(yīng)及突變?nèi)薈D59的補(bǔ)體抑制活性，研究CD59基因突變與腫瘤逃逸的相關(guān)性，進(jìn)一步證實(shí)人CD59與腫瘤逃逸相關(guān)的活性位點(diǎn)，為腫瘤逃逸機(jī)制的進(jìn)一步闡明提供新的理論依據(jù)。 方法:用重組聚合酶鏈反應(yīng)定點(diǎn)誘變技術(shù)構(gòu)建第40位色氨酸缺

2、失的人的CD59突變體(突變1)和第39-41位氨基酸突變?yōu)樯彼岬娜说腃D59突變體(突變2)；與pALTER-MAX質(zhì)粒連接后，用陽離子脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染入HeLa細(xì)胞，以新霉素類似物G418篩選陽性細(xì)胞克隆，以免疫熒光、免疫酶標(biāo)、ELISA、Western-blot、流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步篩選高表達(dá)突變?nèi)薈D59的細(xì)胞株，用免疫組化法檢測(cè)轉(zhuǎn)染人突變CD59的細(xì)胞中腫瘤逃逸相關(guān)分子caspase一3的表達(dá)變化，用乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)試法檢測(cè)突

3、變?nèi)薈D59的抗補(bǔ)體活性。 結(jié)果:酶切鑒定及序列測(cè)定均證實(shí)成功構(gòu)建了兩種人CD59基因突變的重組質(zhì)粒；免疫熒光、免疫酶標(biāo)、ELISA、Western-blot、流式細(xì)胞術(shù)篩選出高表達(dá)突變?nèi)薈D59的細(xì)胞株；免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染突變1后的HeLa細(xì)胞中caspase-3的含量較轉(zhuǎn)染野生型人CD59的HeLa細(xì)胞中的caspase-3的含量明顯增加，轉(zhuǎn)染突變2后的HeLa細(xì)胞中caspase-3的含量較轉(zhuǎn)染野生型人CD59的HeLa