MAPKs在anti-β2GPI-β2GPI復(fù)合物誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)TF中的作用探討.pdf

1、目的:
　　 本課題組前期研究證明,Toll樣受體4(TLR4)及相關(guān)分子-髓樣分化因子88(MyD88)、髓樣分化蛋白-2(MD-2)參與抗β2糖蛋白Ⅰ抗體/β2糖蛋白Ⅰ(anti-β2GPI/β2GPI)復(fù)合物誘導(dǎo)人單核細(xì)胞株THP-1表達(dá)組織因子(TF),且部分依賴膜聯(lián)蛋白Ⅱ(ANX2),成為抗磷脂綜合征(antiphospholipid syndrome,APS)血栓形成的機(jī)制之一。本文著重探討TLR4信號(hào)通路中另一分子

2、家族-絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)在anti-β2GPI/β2GPI復(fù)合物誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)TF中的作用及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　 方法:
　　 1、利用實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-qPCR)檢測(cè)anti-β2GPI/β2GPI復(fù)合物誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞TF mRNA的表達(dá),采用試劑盒檢測(cè)細(xì)胞TF活性。

3、
　　 2、Western bloting檢測(cè)anti-β2GPI/β2GPI復(fù)合物刺激THP-1細(xì)胞MAPKs(p38、ERK1/2及JNK1/2)表達(dá)及其磷酸化情況,并檢測(cè)anti-β2GPI/β2GPI刺激的時(shí)效性和特異性。
　　 3、采用TLR4抑制劑TAK-242預(yù)處理THP-1細(xì)胞,觀察其對(duì)anti-β2GPI/β2GPI復(fù)合物誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞p38、ERK1/2及JNK1/2磷酸化的干預(yù)作用。
　　

4、 4、采用IRAKs抑制劑sc-204013預(yù)處理THP-1細(xì)胞,觀察其對(duì)anti-β2GPI/β2GPI復(fù)合物誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞p38、ERK1/2及JNK1/2磷酸化的干預(yù)作用。
　　 5、采用MAPKs抑制劑SB203580(p38抑制劑)、U0126(ERK1/2抑制劑)、SP600125(JNK1/2抑制劑)預(yù)處理THP-1細(xì)胞,觀察其對(duì)anti-β2GPI/β2GPI復(fù)合物誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)TF的干預(yù)作用。

5、r>　　 結(jié)果:
　　 1、Anti-β2GPI/β2GPI復(fù)合物(100μg/ml)能顯著增加THP-1細(xì)胞TF mRNA水平及TF活性(與未刺激對(duì)照比較p＜0.05)
　　 2、Anti-β2GPI/β2GPI復(fù)合物(100μg/ml)能顯著增加THP-1細(xì)胞p38、ERK1/2及JNK1/2磷酸化水平,并顯示時(shí)間效應(yīng),于刺激30 min時(shí)磷酸化最強(qiáng)(與未刺激比較p＜0.05)。Anti-β2GPI/β2GPI復(fù)合

6、物(100μg/ml)和LPS(500 ng/ml)對(duì)THP-1細(xì)胞MAPKs磷酸化的刺激效應(yīng)一致。
　　 3、TLR4抑制劑TAK-242(5μM)能夠顯著降低anti-β2GPI/β2GPI復(fù)合物誘導(dǎo)的p38、ERK1/2及JNK1/2磷酸化水平(與未經(jīng)TAK-242處理組比較p＜0.05)。
　　 4、IRAKs抑制劑sc-204013(50μM)能夠降低anti-β2GPI/β2GPI復(fù)合物誘導(dǎo)的p38、ERK1

7、/2及JNK1/2磷酸化水平(與未經(jīng)sc-204013處理組比較p＜0.05)
　　 5、p38、ERK1/2及JNK1/2抑制劑[SB203580(10μM)、U0126(5μM)、SP600125(90nM)]分別單獨(dú)預(yù)處理THP-1細(xì)胞,只能部分抑制anti-β2GPI/β2GPI復(fù)合物對(duì)TF表達(dá)的刺激效應(yīng)(與未經(jīng)抑制劑處理組比較p＜0.05);而任意二種抑制劑組合[SB203580(10μM)/U0126(5μM)、U0

8、126(5μM)/SP600125(90nM)、SB203580(10μM)/SP600125(90nM)]預(yù)處理細(xì)胞,可以顯著抑制anti-β2GPI/β2GPI復(fù)合物刺激的TF表達(dá)(與未經(jīng)抑制劑處理組比較p＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 1、自身抗體/抗原復(fù)合物(anti-β2GPI/β2GPI)刺激單核細(xì)胞株THP-1表達(dá)TF,細(xì)胞內(nèi)的重要信號(hào)分子家族MAPKs(p38、ERK1/2及JNK1/2)同時(shí)發(fā)生磷酸

9、化反應(yīng)。
　　 2、在anti-β2GPI/β2GPI復(fù)合物刺激細(xì)胞表達(dá)TF所涉及的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中,細(xì)胞表面TLR4及其信號(hào)通路分子IRAKs作為MAPKs的上游分子參與調(diào)控作用.提示TLR4-IRAKs-MAPKs通路可作為抗磷脂綜合征(APS)血栓形成的防治靶點(diǎn)。
　　 3、在anti-β2GPI/β2GPI復(fù)合物刺激細(xì)胞表達(dá)TF的過(guò)程中,三種MAPKs分子均發(fā)揮重要作用,并且相互之間的級(jí)聯(lián)反應(yīng)存在著復(fù)雜的協(xié)同作用,