免疫復(fù)合物AIgG刺激小鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖過程中Hint2基因的表達(dá)和作用.pdf

1、目的：
　　 1、觀察免疫復(fù)合物AIgG刺激小鼠GMCs后不同增殖狀態(tài)下Hint2-mRNA的表達(dá)量變化情況。
　　 2、觀察Hint2蛋白過表達(dá)對免疫復(fù)合物AIgG刺激的小鼠GMCs不同增殖狀態(tài)下的影響。
　　 方法：
　　 1、采用CCK-8法檢測免疫復(fù)合物AIgG刺激體外培養(yǎng)小鼠GMCs增殖的量-效和時(shí)-效關(guān)系,篩選AIgG的最佳刺激濃度及作用持續(xù)時(shí)間。
　　 2、分別予不同濃度的AIgG(

2、0μg/ml、1000μg/ml、2000μg/ml)刺激小鼠GMCs增殖36小時(shí)后,消化收集細(xì)胞并用PI染色法進(jìn)行處理,再采用流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞各周期的DNA含量進(jìn)行檢測,了解不同濃度的AIgG刺激對小鼠GMCs增殖狀態(tài)的影響。
　　 3、采用SYBR Green Real-time PCR技術(shù)檢測不同濃度的AIgG(0μg/ml、1000μg/ml、2000μg/ml)刺激小鼠GMCs增殖后的Hint2-mRNA表達(dá)量變化情況

3、,觀察小鼠GMCs的增殖狀態(tài)與Hint2-mRNA表達(dá)量之間的關(guān)系。
　　 4、依次構(gòu)建Hint2-Pmd19克隆載體及Hint2-MigR1表達(dá)載體,采用磷酸鈣共沉淀法將MigR1和Hint2-MigR1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染小鼠GMCs后,在熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染后GFP表達(dá)情況,且流式細(xì)胞術(shù)檢測其轉(zhuǎn)染效率。
　　 5、將MigR1和Hint2-MigR1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染小鼠GMCs后,并用流式細(xì)胞術(shù)將兩者轉(zhuǎn)染效率調(diào)整至一致

4、后接種24孔板,分別予不同濃度的AIgG(0μg/ml、1000μg/ml、2000μg/ml)刺激小鼠GMCs36小時(shí)后,再用流式細(xì)胞術(shù)檢測兩者轉(zhuǎn)染細(xì)胞GFP表達(dá)的陽性率,觀察Hint2蛋白過表達(dá)對免疫復(fù)合物AIgG刺激的小鼠GMCs增殖的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1、免疫復(fù)合物AIgG對體外培養(yǎng)小鼠GMCs具有明顯的促增殖作用,增殖效應(yīng)以2000ug/ml劑量組作用最強(qiáng),作用36小時(shí)后達(dá)高峰。
　　 2、不

5、同濃度的AIgG(0μg/ml、1000μg/ml、2000μg/ml)刺激能引起小鼠GMCs增殖指數(shù)(PI值)的改變,且組間P<0.05,同時(shí)提示小鼠GMCs細(xì)胞周期以進(jìn)入S期階段明顯。
　　 3、SYBR Green Real-time PCR結(jié)果采用2-△△CT法相對定量分析提示不同濃度的AIgG(0μg/ml、1000μg/ml、2000μg/ml)刺激小鼠GMCs增殖后,細(xì)胞的PI值越高則Hint2-mRNA表達(dá)量越低

6、。
　　 4、MigR1和Hint2-MigR1質(zhì)粒通過磷酸鈣共沉淀法皆能成功轉(zhuǎn)染小鼠GMCs,熒光倒置顯微鏡可見GFP陽性的細(xì)胞,FCM檢測兩者轉(zhuǎn)染效率分別為38.22％和20.44％。
　　 5、FCM檢測不同濃度的AIgG(0μg/ml、1000μg/ml、2000μg/ml)刺激的轉(zhuǎn)染的小鼠GMCs中GFP的陽性率:Hint2蛋白過表達(dá)組分別為9.99％、7.99％、8.69％,對照組分別為9.23％、8、47％