TLR4基因在CD38---小鼠B細(xì)胞發(fā)育障礙中的作用.pdf

1、目的：
　　TLR4是重要的固有免疫分子，可通過識別病原相關(guān)分子模式，在機體炎性反應(yīng)中扮演重要角色，同時，TLR4還參與腫瘤、動脈粥樣硬化和自身免疫性疾病等的發(fā)生發(fā)展。研究表明，敲除小鼠 CD38基因可引起 B細(xì)胞發(fā)育障礙，主要表現(xiàn)為未成熟B細(xì)胞階段的T1細(xì)胞減少及T2細(xì)胞發(fā)育阻滯。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)在小鼠骨髓中，TLR4只表達于成熟B細(xì)胞，且隨B細(xì)胞遷移至脾臟而顯著升高；TLR4mut小鼠骨髓B細(xì)胞發(fā)育障礙；此外，CD38-/-

2、小鼠脾臟組織中TLR4的表達顯著下降。這些結(jié)果提示CD38和TLR4對B細(xì)胞發(fā)育的影響可能存有內(nèi)在聯(lián)系。本研究旨在進一步探討CD38和TLR4在B細(xì)胞發(fā)育中的作用及其機制，并試圖闡明CD38和TLR4在促進B細(xì)胞發(fā)育過程中的相互作用及可能的信號通路，從而為深入研究B細(xì)胞發(fā)育提供新的線索和依據(jù)。
　　方法：
　　1. WT和CD38-/-雌鼠腹腔注射LPS，兩周后分離其脾臟B細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測B細(xì)胞的發(fā)育、周期和凋亡；

3、>　　2.制備CD38-/-和CD38-/-TLR4mut小鼠；
　　3.提取小鼠尾巴的DNA，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）鑒定小鼠是否成功敲除CD38基因；分別提取CD38-/-和CD38-/-TLR4mut小鼠耳朵的RNA，通過RT-PCR技術(shù)檢測其TLR4的mRNA表達水平；
　　4.通過磁珠分選技術(shù)從 CD38-/-和CD38-/-TLR4mut小鼠脾臟中進一步分選

4、并純化出B細(xì)胞，通過Realtime PCR檢測CD38-/-和CD38-/-TLR4mut小鼠脾臟B細(xì)胞中TLR4的mRNA表達水平，同時檢測炎性因子(包括TNF-α、MCP-1和IL-1β)的表達水平；
　　5.分別提取CD38-/-和CD38-/-TLR4mut小鼠脾臟B細(xì)胞蛋白，通過Western Blot技術(shù)檢測CD38-/-和CD38-/-TLR4mut小鼠脾臟B細(xì)胞中TLR4的蛋白表達水平，同時通過免疫印跡技術(shù)檢測S

5、irt1、NF-κB（p65）和AC-NF-κB的蛋白表達水平；
　　6.通過伊紅染色（hematoxylin-eosin，HE）和免疫組織化學(xué)技術(shù)(Immunohistochemistry，IHC-P)觀察CD38-/-和CD38-/-TLR4mut小鼠脾臟的組織學(xué)差異；
　　7.通過流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry）和相關(guān)表面抗體（包括CD21 FITC、CD24 PE、CD45R PE Cy5.5和IgD AP

6、C等）染色檢測B細(xì)胞的細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果：
　　1. LPS刺激可以顯著促進小鼠B細(xì)胞的發(fā)育；而與WT小鼠相比，CD38-/-小鼠的B細(xì)胞的發(fā)育成熟度明顯下降；CD38-/-小鼠的B細(xì)胞周期被阻滯在S期；
　　2.成功制備并鑒定了CD38-/-TLR4mut小鼠；
　　3.與CD38-/-小鼠相比較，CD38-/-TLR4mut小鼠脾臟B細(xì)胞中TLR4基因和炎性因子MCP-1和TNF-α

7、的mRNA表達水平顯著下降；
　　4.與CD38-/-小鼠相比較，CD38-/-TLR4mut小鼠脾臟B細(xì)胞中TLR4蛋白表達下降，而Sirt1、NF-κB（p65）和AC-NF-κB蛋白表達水平未見明顯改變；
　　5.與CD38-/-小鼠相比較，CD38-/-TLR4mut小鼠脾臟巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)目減少；
　　6.與CD38-/-小鼠相比較，CD38-/-TLR4mut小鼠脾臟B細(xì)胞發(fā)育阻滯更加嚴(yán)重，集中表現(xiàn)在