TLR2-TLR4活化相關(guān)微小RNA在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移、分化中的作用.pdf

1、背景和目的：間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）是一種具有自我更新能力和分化潛能的多功能干細(xì)胞。Toll樣受體（TLRs）是參與天然免疫和獲得性免疫的一類重要蛋白子分子。本課題組前期工作證實(shí)TLR2及TLR4表達(dá)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BM-MSCs）表面并且可以調(diào)節(jié)其遷移、分化等多種生物學(xué)功能。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長約20-22個(gè)核苷酸的RNA分子，能導(dǎo)致靶mRNA降解或翻譯受抑制，從而抑制蛋白質(zhì)合成。近幾年研究表明miR

2、NA可以參與MSCs的分化、增殖、遷移、生存以及旁分泌等一系列重要的生物過程。目前已在多種細(xì)胞類型中證實(shí)TLR信號(hào)可調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)，反之miRNA又可作為重要的調(diào)節(jié)分子調(diào)控TLR信號(hào)。因此，TLR活化相關(guān)miRNA參與調(diào)控MSCs的遷移和分化的可能性較大。本課題組前期證實(shí)了miR-27b、miR-146a、miR-155和miR-154的TLR2/TLR4活化相關(guān)性，提示miR-27b、miR-146a、miR-155和miR-1

3、54參與調(diào)控BM-MSCs的遷移和分化的可能性較大。鑒于此，本文研究了miR-27b、miR-146a、miR-155和miR-154在BM-MSCs遷移及分化中的作用。
　　方法：分離培養(yǎng)健康志愿者的BM-MSCs，分別用 miR-27b、miR-146a、miR-155和miR-154類似物或抑制劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞，qRT-PCR（定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)）分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞相應(yīng)miRNA的表達(dá)量。遷移實(shí)驗(yàn)通過觀察轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞遷移情況，測(cè)

4、定miR-27b、miR-146a、miR-155和miR-154在細(xì)胞遷移中的作用。利用Targetscan version6.2、Miranda、Microcosm Targets Version5三種軟件及基因本體論分析miR-155調(diào)控細(xì)胞遷移可能的靶基因，并利用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。最后利用Western blotting（免疫印跡實(shí)驗(yàn)）檢測(cè)靶基因相應(yīng)蛋白的表達(dá)進(jìn)一步證實(shí)。分化實(shí)驗(yàn)對(duì)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)成脂分化及

5、成骨分化，測(cè)定miR-27b、miR-146a、miR-155和miR-154在細(xì)胞成脂及成骨分化中的作用。
　　結(jié)果：用miR-27b、miR-146a、miR-155和miR-154類似物或抑制劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，四種 miRNA表達(dá)均出現(xiàn)相應(yīng)的上調(diào)或下調(diào)。與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染 miR-27b、miR-146a、miR-155和 miR-154類似物后，相應(yīng)地 miRNA表達(dá)顯著上調(diào)；轉(zhuǎn)染miR-27b、miR-146a、miR-15

6、5和miR-154抑制劑后，相應(yīng)地miRNA表達(dá)顯著下調(diào)。在遷移實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染miR-155類似物可顯著抑制MSCs的遷移，而轉(zhuǎn)染miR-155抑制劑可增強(qiáng)細(xì)胞遷移，說明 miR-155抑制細(xì)胞遷移。通過靶基因預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)和基因本體論分析后，本課題組認(rèn)為MYLK可能是miR-155參與調(diào)控BM-MSCs遷移的靶基因。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示miR-155抑制了MYLK雙熒光素酶報(bào)告載體的熒光活性，從而證實(shí)了MYLK是miR-155靶基因

7、。免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-155類似物后MYLK蛋白表達(dá)下調(diào)，轉(zhuǎn)染miR-155抑制劑后MYLK蛋白表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步證實(shí)了 miR-155通過靶向 MYLK抑制細(xì)胞遷移。而轉(zhuǎn)染miR-27b，miR-146a和miR-154類似物或抑制劑后各組細(xì)胞遷移無顯著差異，說明miR-27b，miR-146a及 miR-154對(duì)細(xì)胞遷移無明顯作用。在分化實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染miR-146a類似物可促進(jìn)BM-MSCs成脂分化而轉(zhuǎn)染miR-146a抑

8、制劑可抑制其成脂分化，說明miR-146a促進(jìn)BM-MSCs的成脂分化。而轉(zhuǎn)染miR-27b、miR-155及miR-154類似物或抑制劑后各組細(xì)胞成脂分化無顯著差異，說明miR-27b、miR-155及miR-154對(duì)BM-MSCs成脂分化均無明顯作用。另外，轉(zhuǎn)染miR-27b、miR-146a、miR-155和miR-154類似物或抑制劑后各組細(xì)胞成骨分化均無顯著差異，提示上述四種miRNA對(duì)BM-MSCs成骨分化均無明顯作用。