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文檔簡介
1、背景和目的:
間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是一種多能干細(xì)胞,具有高度自我更新和分化潛能,多種組織、器官均可分離提取出MSCs。其中,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs)是MSCs最豐富的來源,且易于獲取。Toll樣受體(TLRs)是參與天然免疫和獲得性免疫的一類重要蛋白分子。MicroRNA(miRNA)是一類具有調(diào)控功能的非編碼小分子RNA,大小約19-23個(gè)核苷酸,主要在轉(zhuǎn)錄后對靶基因進(jìn)行調(diào)控。近年來,越來越多的研究發(fā)現(xiàn)和證實(shí)m
2、iRNA參與MSCs的增殖、分化、遷移、生存以及旁分泌等一系列生理和病理過程,并在調(diào)控MSCs的造血支持療效上起了重要作用。目前,多種細(xì)胞類型中已證實(shí):TLR信號可調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá),反之miRNA又可作為重要的調(diào)節(jié)分子調(diào)控TLR信號。因此有理由考慮TLR活化相關(guān)的miRNA參與調(diào)控了MSCs的多種功能。本課題組前期工作證實(shí)TLR2及TLR4表達(dá)于BM-MSCs,并且可以調(diào)節(jié)其遷移、分化等多種生物學(xué)功能。進(jìn)一步采用高通量測序的方法測定
3、分析了Pam3CSK4(TLR2激動(dòng)劑)或LPS(TLR4激動(dòng)劑)刺激后BM-MSCs的miRNA表達(dá)譜變化,并根據(jù)miRNA表達(dá)譜的變化,我們選擇了TLR活化明顯相關(guān)的4種miRNA:高表達(dá)的miR-146a、miR-214,以及表達(dá)顯著下調(diào)的miR-323b、miR-425。觀察上述4種miRNAs對BM-MSCs遷移能力的影響,同時(shí)研究他們對BM-MSCs誘導(dǎo)造血干細(xì)胞遷移與分化的影響。
方法:
分離培養(yǎng)健康志
4、愿者的BM-MSCs,分別用miR-214、miR-146a、miR-323b和miR-425的類似物(miRNA mimic)或抑制劑(miRNA inhibitor)通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染第三代細(xì)胞,實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)檢測各組細(xì)胞中相應(yīng)miRNA的表達(dá)量。用趨化實(shí)驗(yàn)觀察各組貼壁細(xì)胞的遷移能力及各組 MSCs培養(yǎng)上清對人臍帶血CD34+細(xì)胞的遷移能力的影響,酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)定量檢測培養(yǎng)上清中趨化因子SDF-1的分泌水
5、平,流式細(xì)胞術(shù)檢測BM-MSCs表面趨化因子受體4(CXCR4)的表達(dá)情況。構(gòu)建BM-MSCs與臍血CD34+細(xì)胞的共培養(yǎng)體系,2周后,通過流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測造血干細(xì)胞的分化情況,ELISA定量檢測培養(yǎng)上清中造血生長因子IL-1β、IL-8、G-CSF的分泌水平。
結(jié)果:
1.用miR-214、miR-146a、miR-323b和miR-425類似物或抑制劑分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,四種 miRNA表達(dá)量均出現(xiàn)相應(yīng)變化。與對照
6、組相比,轉(zhuǎn)染 miR-214、miR-146a、miR-323b和miR-425類似物后,相應(yīng)的miRNA表達(dá)顯著上調(diào);轉(zhuǎn)染miR-214、miR-146a、miR-323b和miR-425抑制劑后,相應(yīng)的miRNA表達(dá)顯著下調(diào)。
2.miR-323b類似物轉(zhuǎn)染的BM-MSCs的遷移能力受抑,而其抑制物組遷移力明顯增高。流式細(xì)胞術(shù)檢測比較處理后細(xì)胞表面CXCR4的表達(dá)情況,miR-323b類似物組CXCR4表達(dá)量減低。
7、 3.在CD34+細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中,較之空白對照,BM-MSCs的培養(yǎng)上清明顯促進(jìn)CD34+細(xì)胞遷移;與未轉(zhuǎn)染對照組、陰性對照組(NC組)相比,miR-214類似物組BM-MSCs培養(yǎng)上清明顯促進(jìn)CD34+細(xì)胞的遷移,而miR-214抑制物組表現(xiàn)為抑制CD34+細(xì)胞的遷移。ELISA檢測各組的SDF-1濃度無明顯差異。
4.將各組細(xì)胞與CD34+細(xì)胞共培養(yǎng)兩周后,CD34+細(xì)胞的分化趨勢有差異,其中miR-425表達(dá)上調(diào)的BM
8、-MSCs可明顯誘導(dǎo)CD34+細(xì)胞向髓系分化。
5.BM-MSCs的培養(yǎng)上清中IL-1β、IL-8、G-CSF分泌水平變化情況:miR-425類似物組G-CSF的分泌量明顯高于對照組。
結(jié)論:
1.miR-323抑制了BM-MSCs遷移能力,可能與BM-MSCs表面CXCR4表達(dá)受抑有關(guān)。
2.高表達(dá)miR-214的BM-MSCs培養(yǎng)上清可促進(jìn)CD34+細(xì)胞的遷移,其原因與SDF-1無明顯相關(guān)性。
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