溶血磷脂酸上調(diào)CXCL12-CXCR4生物軸與卵巢上皮性癌腹腔轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究.pdf

1、卵巢癌主要來源于卵巢上皮組織，是婦科死亡率最高的惡性腫瘤，約2/3的病人就診時己到臨床晚期，5年生存率僅20～30％，然而，其早期的生存率卻能接近90％。這主要緣于在早期，無論是通過生物標(biāo)記物、影像學(xué)還是其他方法，都沒有有效的診斷方法。同時，卵巢癌具有獨特的生長和轉(zhuǎn)移規(guī)律，表現(xiàn)在癌細(xì)胞于腹膜問皮細(xì)胞間黏附、種植、形成轉(zhuǎn)移灶，最終由于腹腔廣泛病灶累及網(wǎng)膜、胃腸道和肝脾等臟器而致患者死亡。然而，卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移機理尚不明確。因此，對

2、于疾病發(fā)生及發(fā)展過程的理解將有助于我們早期識別卵巢癌及發(fā)現(xiàn)新的、有效的治療方法。溶血磷脂酸(lysophosptlatidic acid，LPA)是新近發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞間磷脂類信號分子，它通過G蛋白偶聯(lián)受體引起多種生物學(xué)效應(yīng)。卵巢癌患者腹水和血漿中LPA水平升高。研究證實，卵巢癌細(xì)胞可以產(chǎn)生LPA，LPA通過誘導(dǎo)許多與血管生成和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因的表達(dá)，有助于卵巢癌細(xì)胞的增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移，并參與血管生成的調(diào)節(jié)以及腫瘤細(xì)胞耐藥的形

3、成。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的，連續(xù)的，多階段過程，研究表明，卵巢上皮性癌選擇性的表達(dá)趨化因子 CXCL12與其特異性受體CXCR4與腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)，CXCL12 與 CXCR4 所構(gòu)成的CXCL12-CXCR4生物軸(CXCL12-CXCR4 biological axis)直接有助于卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并在合適的條件下形成促腫瘤細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，有助于腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。 目的：本課題從臨床入手，首先檢測LPA在卵巢癌患

4、者血漿和腹水中的表達(dá)，繼而體外實驗探討LPA對CXCL12-CXCR4 生物軸的調(diào)節(jié)作用以及LPA調(diào)節(jié)CXCL12-CXCR4生物軸后對卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、分泌的影響和Gi蛋白抑制劑Pemlssis toxin(PTX)對此影響的抑制作用。最后，動物模型進(jìn)一步證實結(jié)論。本課題從臨床到基礎(chǔ)，從體外到體內(nèi)，逐層深入地探討LPA在卵巢癌腹腔轉(zhuǎn)移中的作用及機制，為阻斷卵巢癌腹腔轉(zhuǎn)移提供理論依據(jù)。 方法：本課題分為三部分：

5、 1 LPA在卵巢上皮性癌診斷和病情檢測中的價值。采用北京泰福仕公司生產(chǎn)的LPA試劑盒對初治40例卵巢上皮性癌，20例良性上皮性卵巢腫瘤患者的血漿和20例卵巢上皮性癌患者的腹水及20例良性上皮性卵巢腫瘤患者的腹腔沖洗液測定LPA水平。其中包括20例卵巢癌患者手術(shù)前及術(shù)后的血漿LPA水平。同時測定良惡性卵巢腫瘤患者同期血清CA<,125>水平。分析LPA在卵巢上皮性癌診斷和病情檢測中的價值并與患者年齡、腫瘤病理類型、手術(shù)病理分期、病理分化

6、、CA<,125>等的關(guān)系。 2 L=PA對CxCL12-CXCR4 生物軸的調(diào)節(jié)作用及LPA 調(diào)節(jié)CXCL12-CXCR4生物軸后對卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、分泌的影響及機制。培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞株CAOV3和SKOV3，免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測兩種細(xì)胞膜上的CXCR4蛋白表達(dá)。不同濃度的LPA刺激卵巢癌細(xì)胞，分別作用不同的時間后，采用逆轉(zhuǎn)錄．聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、免疫細(xì)胞化學(xué)和流式細(xì)胞技術(shù)檢測卵巢癌細(xì)胞膜上CXCR4的表達(dá)

7、變化，采用ELISA方法檢測細(xì)胞上清中 CXCL12 的變化。采用MTT比色法，判斷LPA、CXCL12和LPA作用CXCL12 后對卵巢癌細(xì)胞增殖的影響。以rrranswell侵襲小室為模型，應(yīng)用Matrigel探討LPA、CXCL12和LPA作用CXCL12后對卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響。ELISA 法用于測定在LPA、CXCL12和LPA作用CXCL12后，卵巢癌細(xì)胞分泌VEGF的變化。同時，觀察Gi蛋白抑制劑PTX對此影響的抑制

8、作用。 3 溶血磷脂酸對卵巢癌細(xì)胞在移植瘤動物模型中生長轉(zhuǎn)移和相關(guān)因子表達(dá)的影響。將6×106個未經(jīng)處理的卵巢癌細(xì)胞株SKOV3 (對照組)和用LPA刺激后的SKOV3細(xì)胞(LPA處理組)分別注入裸鼠腹腔，每組10 只，自移植腫瘤后第二天起，LPA處理組裸鼠每日腹腔注射LPA0.134mg/20g，對照組裸鼠每日腹腔注射等量的生理鹽水，共13天。待裸鼠自然死亡后，觀察移植瘤大小、質(zhì)量、腹腔轉(zhuǎn)移情況。免疫組化和流式細(xì)胞技術(shù)分析兩組

9、移植瘤組織中的VEGF、MMP2、COX-2和CXCR4 的蛋白表達(dá)變化。 結(jié)果： 1 ①卵巢癌患者手術(shù)前血漿LPA值5.89±1.98μmol/L，明顯高于良性對照組平均值1.65±0.71 μmol/L，兩組相比有顯著性差異(p<0.001)。②LPA對于卵巢癌診斷的陽性率為97.5％，明顯高于CA<,125>的陽性率77.5％，且特異性80％(16/20)也優(yōu)于CA<,125>的特異性40％(8/20)。卵巢癌患者

10、手術(shù)前血漿LPA和CA<,125>水平相關(guān)性比較，二者有相關(guān)性，且呈正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)r=0.736，p<0.01)。③卵巢癌患者血漿的LPA水平在不同的腫瘤病理類型、手術(shù)病理分期和病理分化方面各組相比都無顯著性差異(p>0.05)。④所有卵巢癌患者手術(shù)后LPA水平2.87±1.34μmol/L均明顯低于術(shù)前5.89±1.98μmol/L，兩者相比有顯著性差異(p<0.001)。⑤所有卵巢癌患者腹水LPA水平均值(5.68±1.75μmo

11、l/L)，明顯高于良性腹腔沖洗液的LPA水平(1.34±0.77μmol/L)，兩者相比有顯著性差異(p<0.001)。⑥20例卵巢癌患者中有13例患者腹水LPA水平高于其血漿水平，且腹水LPA水平均值5.68±1.75μmol/L 高于血漿 LPA 水平均值5.346±1.93μmol/L，但兩者相比差異無顯著性(p>0.05)。 2 ①免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，卵巢癌細(xì)胞CAOV3和SKOV3，在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中均有CXCR4蛋

12、白表達(dá)。②RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)和流式細(xì)胞技術(shù)結(jié)果顯示，不同濃度(0、5、20)μM的LPA刺激細(xì)胞24h，以及20gMLPA在不同的時間(0、12h、24h)作用于細(xì)胞后，CXCR4的mRNA和蛋白表達(dá)水平均高于對照組，且20μMLPA組高于5μMLPA組，24h組高于12h組，各組相比差異有顯著性(p<0.01)。③ELISA 方法檢測結(jié)果顯示，在不同濃度的LPA刺激細(xì)胞后作用不同的時間，卵巢癌細(xì)胞上清的CXCL12 表達(dá)水平同

13、CXCR4 一樣升高。④在無牛血清條件下，100ng/mlCXCL12可刺激卵巢癌細(xì)胞CAOV3和SKOV3增殖(p<0.05)，將20μMLPA與100ng/mlCXCL12結(jié)合作用細(xì)胞24h后，增殖作用明顯增強(p<0.05)，同時使用Gi蛋白抑制劑PTX后，增殖作用又趨于減弱(p<0.05)。表明LPA具有促進(jìn)CXCL12 對卵巢癌細(xì)胞增殖的作用。⑤100ng/mlCXCL12 對卵巢癌細(xì)胞CAOV3和SKOV3的遷移有明顯的趨化

14、性(p<0.05)，結(jié)合了20μMLPA后，對細(xì)胞的趨化作用更強，遷移的細(xì)胞數(shù)較單獨使用CXCL12顯著增多(p<0.05)。Gi蛋白抑制劑PTX，使遷移的細(xì)胞數(shù)較前減少，證明LPA可以加強CXCL12的趨化作用。在無牛血清培養(yǎng)液作為對照時，卵巢癌細(xì)胞CAOV3和SKOV3穿過Matrigel的細(xì)胞數(shù)很少，100ng/mlCXCL12刺激后，穿過Matrigel的細(xì)胞數(shù)較前增多(p<0.05)，加入20μMLPA后，作用明顯增強(p<0

15、.05)，但是隨著 Gi蛋白抑制劑PTX的加入，穿過Matngel的細(xì)胞數(shù)又有所減少(p<0.05)。說明LPA可以促進(jìn)CXCL12對卵巢癌細(xì)胞的侵襲作用。⑥100ng/mlCXCL12 可使卵巢癌細(xì)胞CAOV3和SKOV3分泌VEGF增多(p<0.05)，LPA作用于CXCL12后，可以加強這一作用(p<0.05)。 3 ①未經(jīng)處理的SKOV3細(xì)胞移植裸鼠后平均在13.75±1.04天腹腔移植瘤形成，平均生存期27.63±1.

16、92天。LPA處理的SKOV3 細(xì)胞移植裸鼠后于12.88±1.25天在腹腔形成移植瘤，腫瘤形成日期與對照組相比無明顯差別(p>0.05)，LPA處理組裸鼠平均生存期23.57±2.37天，明顯低于對照組裸鼠(p<0.05)。②兩組荷瘤裸鼠自然死亡后解剖腹腔后顯示，均于左下腹形成腹腔移植瘤，成瘤率100％。對照組裸鼠的腹腔大網(wǎng)膜、腸系膜有輕度粘連，腹腔轉(zhuǎn)移灶多見，以腹膜和橫隔下為主，平均為12.3±4.56個。LPA組裸鼠的腹腔大網(wǎng)膜、

17、腸系膜均發(fā)生重度粘連，移植瘤與肝臟、脾臟和腸管粘連緊密，腹腔轉(zhuǎn)移灶也以腹膜和橫隔下為主，平均16.3±4.06個，明顯多于對照組，有顯著性差異(p<0.05)。③對照組裸鼠腹腔移植瘤的平均重量是2.91±0.87g，LPA處理組的平均瘤重3.81±1.04g，明顯大于對照組(p<0.05)。④免疫組化和流式細(xì)胞技術(shù)結(jié)果顯示，LPA 處理組的移植瘤組織中VEGF、MMP2、COX-2和CXCR4蛋白表達(dá)水平均高于對照組(p<0.05)。表