溶血磷脂酸參與骨癌痛外周機制的研究.pdf

1、癌癥是目前醫(yī)學界最難以治療的疾病之一。癌癥中異常增生的腫瘤細胞能夠逐步破壞周圍組織和器官的結構與功能,同時產生癌癥痛等癥狀,對病人的生理及心理造成嚴重的影響。
　　溶血磷脂酸(Lysophosphatidicacid,LPA)是由羥基丙三醇、磷酸鹽基團以及長鏈脂肪酸三部分組成的簡單脂類分子。近年來大量的研究報導證明LPA通過LPA1-5五種受體亞型參與了癌癥細胞的抗凋亡、增殖和轉移等活動,是調控癌癥發(fā)展的重要分子。同時也有研究指出

2、,LPA通過其LPA1受體也參與了外周痛覺信息的傳遞,特別在神經病理痛的產生中起到了重要的作用。
　　外周神經損傷所導致的神經病理痛是癌癥痛產生的主要機制之一。然而,作為在癌癥發(fā)展的過程中以及在神經病理痛的形成中都起到關鍵調控作用的LPA,目前尚無相關報道證明它是否參與了癌癥痛的產生。因此,本研究工作以大鼠脛骨骨髓腔內接種WALKER256乳腺癌細胞建立的骨癌痛模型為研究對象,采用行為學、形態(tài)學、分子生物學以及電生理的方法,觀察了

3、癌細胞對外周神經纖維的影響,以及LPA在形成的骨癌痛中所起的作用,并且進一步探討了LPA在參與骨癌痛形成中所涉及的下游信號通路,為癌癥痛的臨床治療提供了可能的理論依據。
　　1.骨癌模型及相關行為學和形態(tài)學變化
　　臨床骨癌病例最明顯的特征就是骨內癌細胞對骨質的破壞,以及產生嚴重的骨癌痛。骨癌模型動物的X光影像分析表明,在接種腫瘤細胞16天后,骨癌大鼠的脛骨內就已經出現了明顯的骨質損傷。脛骨隨著癌癥的發(fā)展會產生明顯的變形,術

4、后25天后整個骨頭變得非常脆弱,甚至發(fā)生骨折。
　　vonFrey機械刺激誘導的骨癌痛從術后第7天開始出現,機械閾值由術前的15.88±2.36g變?yōu)?.00±1.03g,術后第16天痛敏達到最高峰,閾值降低到4.68±0.79g。通過對1g到16g之間不同強度機械刺激的反應情況進行對比,骨癌大鼠不僅對能引起正常動物痛行為的高強度機械刺激(≥15g)產生了痛覺過敏,同時對原本不能引起正常大鼠痛行為的低強度機械刺激(＜15g)也變得

5、敏感,形成了觸誘發(fā)痛現象,說明骨癌大鼠外周支配皮膚神經中的A纖維與C纖維都受到癌癥細胞的影響發(fā)生了敏化。本研究選擇術后16天左右的大鼠進行進一步骨癌痛機制研究。
　　2.骨癌大鼠的外周神經纖維損傷及其電生理特性
　　通過形態(tài)學和電生理的方法來觀察癌癥細胞對外周神經纖維的影響。免疫組化觀察外周神經損傷標志物激活轉錄因子3(activatingtranscriptionfactor3,ATF3)的表達,結果顯示在骨癌大鼠術側腰4

6、、腰5節(jié)段的背根節(jié)(dorsalrootganglia,DRG)神經元胞體中,ATF3表達量上調(每片DRG切片ATF3陽性細胞表達量比較:骨癌組=14.45,假手術組=2.02),說明骨癌大鼠外周神經纖維上發(fā)生了損傷。
　　大鼠后關節(jié)囊神經與腓腸神經分別為支配脛骨骨髓腔和支配小腿及腳掌外側皮膚的神經纖維,它們分別代表了骨內神經纖維與骨外神經纖維。在體記錄骨癌大鼠后關節(jié)囊神經與腓腸神經的多單位動作電位發(fā)放,結果顯示后關節(jié)囊神經受骨

7、內腫瘤細胞直接作用后,平均自發(fā)放電頻率大大降低(骨癌組=O.16Hz,假手術組=0.97Hz),且對骨髓腔內機械或辣椒素刺激的敏感性也由術前的100％降低到僅剩28.6％。然而腓腸神經在受骨內腫瘤細胞間接影響后,自發(fā)放電頻率顯著升高(骨癌組=0.75Hz,假手術組=0.28Hz)。
　　通過首次建立的離體腓腸神經-腳掌皮膚的電生理實驗進一步觀察腫瘤細胞對外周皮膚神經的敏化作用。結果顯示,在有少部分腓腸神經纖維發(fā)生壞死而失去電生理興

8、奮能力的同時,未受損的神經纖維興奮性增強,其中A纖維與C纖維均表現出更高的自發(fā)放電比例(Acancer=52.11％,Ccancer=28.57％,Asham=33.85％,Csham=22.58％)。
　　這些結果在進一步的證明了行為學實驗結果的同時,更說明了骨癌對于其支配范圍內神經纖維和鄰近的支配區(qū)外神經纖維的影響是不一樣的,腫瘤細胞直接作用于支配區(qū)內的神經纖維,可能通過機械壓迫和酶解等手段造成了大量的神經纖維壞死:對于支配范

9、圍外的神經纖維,腫瘤細胞則可能通過間接的作用使其產生敏化,從而表現出機械刺激皮膚引起的痛敏。
　　3.LPA參與骨癌大鼠的外周神經纖維敏化
　　LPA是腫瘤細胞大量釋放的物質之一,對癌癥發(fā)展及神經損傷都起到重要的調控作用,因此,我們進一步通過分子生物學及電生理的方法來觀察LPA在腫瘤細胞引起的外周神經敏化中所扮演的角色。
　　Westernblot觀察外周DRG中LPA1受體的表達,結果顯示骨癌動物DRG的LPA1表達

10、量上調,說明LPA及其LPA1受體確實參與了癌癥引起的外周神經系統的生理性變化。
　　在建立的離體標本中,首先清洗掉標本中的血液,去除脛骨,從而排除掉血小板和腫瘤細胞這兩個LPA的主要來源,然后再給予標本外源性的LPA,能夠引起腓腸神經單纖維上動作電位發(fā)放,且該反應在骨癌大鼠中的敏感要遠遠高于假手術大鼠,其中C纖維的變化尤為明顯(骨癌組=81.25％,假手術組=22.22％)。說明癌癥引起了LPA對于外周神經纖維的刺激性增強,進一

11、步的證明了LPA參與骨癌痛的產生。
　　LPA1受體是LPA表達于外周神經系統中的主要受體亞型,同時有報導指出P物質(substanceP,SP)及其受體NK-1參與了LPA引起的疼痛。我們將離體骨癌標本提前給予LPA1受體拮抗劑VPC32183或者NK-1受體拮抗劑WIN51708,均能夠抑制LPA誘導的動作電位發(fā)放,說明LPA通過LPA1以及NK-1受體信號通路來參與腫瘤細胞引起的骨癌痛外周機制。
　　綜上所述,本研究結