大鼠骨癌痛外周機(jī)制的研究-溶血磷脂酸調(diào)制TRPV1電流及其信號(hào)通路分析.pdf

1、癌癥(cancer)，醫(yī)學(xué)術(shù)語(yǔ)亦稱(chēng)惡性腫瘤(malignant neoplasm)，它是由控制細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的機(jī)制失常而引起的疾病。癌細(xì)胞除了生長(zhǎng)失控外，還會(huì)局部侵入周遭正常組織甚至經(jīng)由體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)或淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到身體其他部分，骨是最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移灶之一。骨癌伴隨的疼痛嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量。
　　溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)是一類(lèi)具有生物活性的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的甘油磷脂類(lèi)物質(zhì)，它普遍存在于所有真核生物的各種

2、組織內(nèi)，具有廣泛的生物學(xué)功能，包括細(xì)胞增殖、遷移、心血管功能、傷口愈合、細(xì)胞粘連以及調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的釋放等。目前發(fā)現(xiàn)LPA有五類(lèi)受體，LPA1-5，它們均為G蛋白偶聯(lián)受體，在外周感覺(jué)傳入初級(jí)神經(jīng)元背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)細(xì)胞上主要表達(dá)LPA1受體。近年來(lái)的許多報(bào)道表明，LPA參與腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，以及神經(jīng)病理痛的產(chǎn)生。然而，尚不清楚LPA是否也參與癌癥痛的產(chǎn)生。
　　辣椒素受體(TRPV1)

3、是一類(lèi)非選擇性陽(yáng)離子通道，能被辣椒素、傷害性熱刺激、酸以及多種內(nèi)源性配體所激活而產(chǎn)生內(nèi)向電流。TRPV1是特異表達(dá)在傷害性感受器上傳遞疼痛信息的一類(lèi)重要的信號(hào)分子，近年來(lái)的研究表明它在骨癌痛中發(fā)揮著重要的作用。TRPV1受體可以被許多炎癥介質(zhì)如緩激肽、趨化因子和P物質(zhì)等所調(diào)制。
　　本論文在大鼠脛骨骨髓腔內(nèi)接種WALKER256乳腺癌細(xì)胞的骨癌痛模型上，應(yīng)用X光檢測(cè)、透射電鏡、免疫熒光組織化學(xué)、蛋白免疫印跡、全細(xì)胞膜片鉗以及行為學(xué)

4、等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，研究了骨癌動(dòng)物外周形態(tài)學(xué)和行為學(xué)的變化、LPA在骨癌痛形成中的作用、LPA對(duì)TRPV1受體的調(diào)制及其可能的信號(hào)通路。主要結(jié)果如下：
　　1.骨癌痛模型：行為學(xué)和形態(tài)學(xué)變化
　　1.1.大鼠骨癌痛模型的建立
　　大鼠脛骨骨髓腔內(nèi)接種WALKER256乳腺癌細(xì)胞后，出現(xiàn)了類(lèi)似臨床的病理特征如機(jī)械痛敏、骨質(zhì)損傷和體重下降等系列的行為和形態(tài)學(xué)的變化。在腫瘤接種后的第15天，X光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)骨癌大鼠術(shù)側(cè)脛骨發(fā)生了嚴(yán)重的骨

5、質(zhì)損傷，骨內(nèi)局部結(jié)構(gòu)缺失，邊緣模糊，骨內(nèi)密度不均勻，關(guān)節(jié)邊緣的骨質(zhì)被明顯地侵蝕和破壞。在此階段，骨癌動(dòng)物狀態(tài)較差，體形瘦弱，攝食減少，反應(yīng)遲鈍，毛色暗沉，患側(cè)腿很少負(fù)重，輕觸即可引起疼痛。接種16天以后骨癌大鼠狀態(tài)逐漸變差，并開(kāi)始陸續(xù)死亡。
　　利用von Frey探針測(cè)試對(duì)骨癌痛的發(fā)展時(shí)程進(jìn)行了檢測(cè)。和假手術(shù)動(dòng)物相比，骨癌動(dòng)物在接種后的第7天，其機(jī)械縮腿反射閾值(Ppaw withdrawl threshold，PWT)有明顯的

6、降低，即出現(xiàn)了機(jī)械觸誘發(fā)痛(allodynia)，之后其PWT值持續(xù)降低，接種后第16天降到最低。之后可能由于骨癌的發(fā)展導(dǎo)致骨癌大鼠行動(dòng)能力受到影響而使PWT值有了回升。
　　1.2.骨癌引起的大鼠外周神經(jīng)系統(tǒng)的變化
　　通過(guò)透射電鏡和免疫熒光組織化學(xué)染色技術(shù)觀察了骨癌大鼠外周神經(jīng)系統(tǒng)的變化。后關(guān)節(jié)囊神經(jīng)是脛神經(jīng)的一個(gè)分支，它支配著脛骨骨麓腔。對(duì)接種后第14天的骨癌動(dòng)物和假手術(shù)動(dòng)物的后關(guān)節(jié)囊神經(jīng)進(jìn)行了透射電鏡觀察。結(jié)果顯示，

7、和假手術(shù)動(dòng)物后關(guān)節(jié)囊神經(jīng)形狀規(guī)則、結(jié)構(gòu)完整的髓鞘相比，骨癌動(dòng)物的后關(guān)節(jié)囊神經(jīng)有明顯的脫髓鞘現(xiàn)象，部分神經(jīng)的髓鞘結(jié)構(gòu)已經(jīng)被完全破壞，表明骨癌動(dòng)物中支配骨髓腔的神經(jīng)纖維受到了明顯的損傷。
　　激活轉(zhuǎn)錄因子3(activating transcdption factor3，ATF3)是激活轉(zhuǎn)錄因子/cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(activating transcription factor/cAMP-responsiveelement bi

8、nding.protein，ATF/CREB)家族的成員之一，通常被用來(lái)作為神經(jīng)損傷的神經(jīng)元標(biāo)記物。采用免疫熒光組織化學(xué)觀察了接種后第14天骨癌動(dòng)物和假手術(shù)動(dòng)物雙側(cè)腰4-6(lumber4-6，L4-6)節(jié)段的DRG中ATF3的表達(dá)。結(jié)果顯示，骨癌動(dòng)物術(shù)側(cè)L4、5節(jié)段DRG中ATF3的表達(dá)明顯上調(diào)，并且和大細(xì)胞標(biāo)記物神經(jīng)微絲蛋白200(neurofilament200，NF200)以及肽能小細(xì)胞標(biāo)記物降鈣素基因相關(guān)肽(calcitoni

9、n gene-related peptide，CGRP)均存在大量的共標(biāo)，而與非肽能小細(xì)胞標(biāo)記物異凝集素B4(griffonia simplicifolia isolectin B4，IB4)幾乎不存在共標(biāo)。表明骨癌動(dòng)物術(shù)側(cè)腰4-5節(jié)段DRG中大細(xì)胞和肽能小細(xì)胞存在大量損傷，而非肽能小細(xì)胞則幾乎沒(méi)有損傷。
　　2.LPA對(duì)骨癌大鼠外周傷害性感受器的作用
　　2.1.LPA1受體表達(dá)的上調(diào)及其拮抗劑對(duì)骨癌痛的抑制
　　為

10、了研究LPA在骨癌痛中可能發(fā)揮的作用，檢測(cè)了接種后第14天骨癌動(dòng)物術(shù)側(cè)DRG L4-6節(jié)段中LPA1受體表達(dá)的變化。蛋白免疫印跡法(westernblot)結(jié)果表明，和假手術(shù)動(dòng)物相比，接種后第14天骨癌動(dòng)物術(shù)側(cè)DRG L4-6中LPA1受體表達(dá)明顯上調(diào)，提示LPA及其受體LPA1可能參與了骨癌痛的產(chǎn)生。因此，進(jìn)一步利用LPA1拮抗劑VPC32183研究了LPA1的激活在骨癌痛中的作用。分別在接種前和接種后第2、4、7和9天，通過(guò)腰穿給藥

11、(lumberpuncture，i.p.)的方式對(duì)骨癌動(dòng)物鞘內(nèi)給予VPC32183或生理鹽水，作為給藥組和對(duì)照組。結(jié)果表明，和對(duì)骨癌動(dòng)物給予生理鹽水相比，鞘內(nèi)給予VPC32183可以部分翻轉(zhuǎn)骨癌動(dòng)物機(jī)械觸誘發(fā)痛和熱痛敏的形成，表明LPA1的激活參與了骨癌痛的產(chǎn)生。
　　2.2.LPA對(duì)TRPV1通道活動(dòng)的增強(qiáng)
　　基于TRPV1受體是傷害性感受器的重要信號(hào)分子，為此檢測(cè)了骨癌動(dòng)物DRG中TRPV1受體的變化。利用wester

12、n blot和急性分離的DRG神經(jīng)元的全細(xì)胞膜片鉗等實(shí)驗(yàn)技術(shù)分別檢測(cè)了接種后第14-16天骨癌動(dòng)物術(shù)側(cè)DRG中TRPV1受體表達(dá)量的變化以及TRPV1電流幅度的變化。結(jié)果表明，和假手術(shù)動(dòng)物相比，接種后第14-16天骨癌動(dòng)物術(shù)側(cè)DRG中TRPV1受體的表達(dá)明顯上調(diào)。
　　為了降低TRPV1受體對(duì)辣椒素的脫敏作用，采用較低濃度(0.5μM)的辣椒素來(lái)誘導(dǎo)產(chǎn)生TRPV1電流。將接種后第14-16天的骨癌動(dòng)物和假手術(shù)動(dòng)物術(shù)側(cè)L4-6的DR

13、G神經(jīng)元上由0.5μM辣椒素引起的TRPV1電流幅度度進(jìn)行了比較。由于細(xì)胞的個(gè)體差異，每個(gè)細(xì)胞對(duì)0.5μM辣椒素引起的電流幅度差異很大，因此，將所有細(xì)胞按照其電流幅度的不同分成兩組，電流幅度低于100 pA的為低電流組，電流幅度高于100 pA的為高電流組。結(jié)果表明，和假手術(shù)動(dòng)物相比，骨癌動(dòng)物中低電流組和高電流組電流的平均幅度均有顯著上調(diào)。
　　2.3.LPA對(duì)TRPV1電流調(diào)制的胞內(nèi)信號(hào)通路
　　利用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)檢測(cè)了

14、LPA1受體和TRPV1受體在DRG神經(jīng)元上的共表達(dá)。結(jié)果顯示，LPA1受體和TRPV1受體在DRG神經(jīng)元上存在大量的共表達(dá)，這為它們之間可能的相互作用提供了形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。
　　急性分離的DRG神經(jīng)元的全細(xì)胞膜片鉗記錄了LPA對(duì)TRPV1電流的調(diào)制作用。結(jié)果表明，LPA可以增強(qiáng)0.5μM辣椒素引起的TRPV1電流，這種增強(qiáng)作用呈時(shí)間依賴(lài)性。在給予LPA一分鐘后，TRPV1電流開(kāi)始增大，直到給藥后的第3分鐘，電流增到最大，之后電流慢慢

15、減小，第9分鐘回到基礎(chǔ)水平。同時(shí)，LPA對(duì)TRPV1電流的調(diào)制作用也呈劑量依賴(lài)性，分別給予1μM，0.1μM或0.01μM LPA一分鐘后，辣椒素電流分別增加了221±37％，109±19％和58±9％，而0.001μM LPA對(duì)TRPV1電流沒(méi)有明顯的增強(qiáng)。
　　與正常動(dòng)物相比，在骨癌動(dòng)物中，LPA對(duì)TRPV1電流的調(diào)制作用更明顯。在假手術(shù)動(dòng)物中，極低濃度的辣椒素(0.5 nM)不能誘發(fā)內(nèi)向電流，而40％的骨癌動(dòng)物的背根神經(jīng)節(jié)神

16、經(jīng)元對(duì)0.5 nM的辣椒素有反應(yīng)。對(duì)0.5 nM的辣椒素?zé)o反應(yīng)的骨癌動(dòng)物DRG神經(jīng)元中，0.01μM LPA可以誘導(dǎo)0.5 nM的辣椒素產(chǎn)生一個(gè)內(nèi)向電流，然而，這種現(xiàn)象在假手術(shù)動(dòng)物中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)，表明LPA在骨癌狀態(tài)下能易化辣椒素電流。
　　進(jìn)一步研究了LPA調(diào)制TRPV1可能的信號(hào)通路。在給予LPA之前，將細(xì)胞分別給予LPA1受體拮抗劑VPC32183、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)拮抗劑BIM、PKCε拮

17、抗劑εV1-2、蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)拮抗劑H89以及小G蛋白R(shí)ho抑制劑BoTXC3，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VPC32183、BIM以及εV1-2均可以阻斷LPA對(duì)TRPV1電流的增強(qiáng)，而H89和BoTXC3不能影響LPA對(duì)TRPV1電流的易化作用。該結(jié)果表明，LPA對(duì)TRPV1受體的調(diào)制作用是通過(guò)其受體LPA1來(lái)完成的，并依賴(lài)于其下游PKC信號(hào)通路，尤其是PKCε亞型的激活，而PKA和：Rho-Rock通路并不參與