ERβ基因衰老性甲基化對結腸癌細胞雌激素信號傳導通路的表觀遺傳學調控的研究.pdf

1、研究目的： 了解結腸癌細胞中雌激素信號傳導通路（Estrogen Signaling）的異常甲基化模式以及其與轉錄失活的因果關系，探討雌激素受體β亞型基因（Erβ）對雌激素信號傳導通路的表觀遺傳學調控方式，從不同層次上深入研究Erβ基因衰老性甲基化的表觀遺傳學機制及其病理意義，了解Erβ基因甲基化在結腸癌早期診斷、預防、預后評估以及治療中的應用價值，尤其是雌激素抑制結腸腫瘤發(fā)生的作用機制，探索將此抑制作用用于已發(fā)生的腫瘤的治療過

2、程的應用價值和方法。 研究方法： 在整個一系列實驗過程中，作為預實驗部分，首先采用甲基化特異性PCR（MSP）方法了解了結腸癌細胞株（HT-29，Caco-2和Lovo）中Erβ及其靶基因PR（含經(jīng)典的ERE元件）和c-fos原癌基因（含非經(jīng)典的AP-1結合位點）啟動子CpG島的甲基化模式，采用常規(guī)PCR方法檢測了結腸癌細胞株中Erβ基因、hMLH1基因、DNA甲基化轉移酶1（Dnmt1）、DNA甲基化轉移酶3a（Dnm

3、t3a）、DNA甲基化轉移酶3b（Dnmt3b）以及組蛋白甲基化轉移酶(HMT)等表觀遺傳學酶譜的表達水平，為后續(xù)的研究打下基礎。 在此基礎上，采用針對Erβ基因的RNAi技術體外抑制Erβ基因的表達，觀察了Erβ基因轉錄失活對PR和c-fos基因啟動子甲基化模式的調控以及表觀遺傳學酶譜表達的影響；同時，采用雌激素誘導或外源性Erβ基因導入等不同手段，正向調節(jié)Erβ基因表達，觀察Erβ基因表達恢復或激活對雌激素信號傳導通路靶基因

4、啟動子甲基化模式的調控以及表觀遺傳學酶譜表達的影響。通過對Erβ基因正反兩個方向的表達調節(jié)，觀察除了經(jīng)典的受體-配體結合方式外，Erβ基因是否還存在表觀遺傳學調控方式或機制。 接下來的研究中，采用“甲基化特異性寡核苷酸技術”，設計并合成針對Erβ基因的特異性甲基化寡核苷酸片段，作用于原代培養(yǎng)的雌性乳鼠結腸上皮細胞中，以誘導Erβ基因啟動子發(fā)生特異性甲基化而失活，從而體外構建Erβ基因衰老性甲基化的結腸上皮細胞模型，以期模擬或者還

5、原Erβ基因在結腸癌細胞中的表型和基因型，并在此基礎上觀察Erβ基因衰老性甲基化對雌激素信號傳導通路的表觀遺傳學調控效應，深入探討Erβ基因衰老性甲基化的表觀遺傳學機制及其病理意義，尤其是在雌激素預防女性結腸癌發(fā)生中可能的作用機理，為研究結腸癌的發(fā)病機制、預防和早期診治結腸癌提供相關理論依據(jù)和實驗基礎。 研究結果： 雌激素信號傳導通路相關基因中，Erβ及其靶基因PR啟動子CpG島在結腸癌細胞株HT-29、Lovo和Cac

6、o-2中均呈現(xiàn)為典型的異常高甲基化模式；原癌基因c-fos啟動子CpG島在三株結腸癌細胞中則表現(xiàn)為不完全性的部分甲基化。 RT-PCR檢測結果顯示，與內參基因相比，ErβmRNA在三株結腸癌細胞中均呈現(xiàn)為弱表達狀況。細胞爬片的免疫組織化學檢測結果顯示，Erβ蛋白主要定位在胞核，胞漿也有少量表達，其中在Caco-2中呈現(xiàn)中低度表達狀況，在Lovo和HT-29中則表現(xiàn)為弱表達。總的來說，無論是ERβmRNA還是Erβ蛋白在三株癌細胞

7、株中的表達都是被抑制的。hMLH1基因mRNA在三株結腸癌細胞中的表達無顯著差異，均表現(xiàn)為中度表達水平。Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b和HMT在結腸癌細胞株中呈現(xiàn)不等的表達水平，Dnmt3a、Dnmt3b在分化良好的癌細胞中呈現(xiàn)過度表達狀況，而在分化不良或未分化的癌細胞中則被抑制表達。 針對Erβ基因設計的特異性小干擾RNA片段（siRNA）作用于Caco-2后，Erβ基因mRNA表達顯著下調；然而，Caco-2細胞中E

8、rβ，PR和c-fos等基因啟動子甲基化模式在RNAi前后卻無任何改變；同時，對Dnmt1，Dnmt3a，Dnmt3b，HMT和hMLH1基因mRNA的檢測也發(fā)現(xiàn)，RNAi作用前后這些基因的表達無顯著改變。 終濃度分別為10-6mol/L、10-8mol/L的雌二醇（E2）分別作用于Caco-2細胞兩周后，Erβ基因表達無明顯增高或其他改變。提示，單純應用E2作用癌細胞可能并不能誘導Erβ的表達。接下來的研究采用常規(guī)基因重組技術

9、構建Erβ真核表達載體并導入結腸癌細胞Caco-2。結果表明，外源性Erβ基因的導入可以顯著的激活雌激素信號傳導通路基因（PR、c-fos）的表達(P<0.01)，與此同時，該通路基因總體甲基化密度顯著降低。結合甲基化酶譜(Dnmt1,Dnmt3a,Dnmt3b和HMT)表達水平的改變，本研究推測，這種調控作用很可能是通過去甲基化機制來實現(xiàn)的。不過，因為并沒有完全逆轉原有的高甲基化模式，因此，Erβ對PR、c-fos的調控作用很可能是但

10、又不完全是通過去甲基化機制來實現(xiàn)的。換句話說，結腸癌細胞中Erβ基因激活可以部分地逆轉雌激素信號傳導通路基因的甲基化模式，使PR基因（含經(jīng)典的ERE元件）和c-fos原癌基因（含非經(jīng)典的AP-1結合位點）發(fā)生部分去甲基化并恢復近似正常的表達，在此過程中Erβ基因本身也發(fā)生了去甲基化改變。此外，Erβ基因導入Caco-2后，hMLH1表達也明顯降低。Erβ與hMLH1之間是否存在以及存在何種相關性，尚有待進一步研究。 本研究成功的

11、進行了SD新生大鼠結腸上皮細胞的體外原代培養(yǎng)，免疫組織化學檢測表明，上皮細胞純度達95％以上。針對Erβ基因設計合成的特異性甲基化寡核苷酸（MO）片段成功轉染進入了結腸上皮細胞，并且在增殖比較旺盛的細胞團塊中富集。MSP檢測結果表明，轉染進入細胞的MO片段成功誘導了Erβ基因啟動子的特異性甲基化。結腸上皮細胞Erβ基因衰老性甲基化模型的建立，為從表觀遺傳學角度研究Erβ基因在結腸癌發(fā)生機制中的作用奠定了堅實的基礎。 深入研究發(fā)現(xiàn)

12、，Erβ基因發(fā)生衰老性甲基化而滅活的同時，下游的靶基因PR和c-fos的表達也顯著降低。對表觀遺傳學酶譜的檢測則表明，MO誘導前后從頭甲基化酶（Dnmt3a,Dnmt3b）和組蛋白甲基化酶（HMT）的表達也發(fā)生了顯著的改變，維持甲基化酶（Dnmt1）的表達卻無明顯變化。這表明，整個過程中發(fā)生了顯著的酶促條件下的從無到有的基因高甲基化和組蛋白高甲基化等表觀遺傳學基因型改變。結合正常結腸上皮細胞中該通路非甲基化或低甲基化這一事實，就更容易理

13、解上述改變。 研究結論： 本研究結果提示，在結腸上皮細胞中，除了經(jīng)典的受體-配體結合方式外，Erβ基因還存在著表觀遺傳學作用方式和機制，作為結腸上皮細胞中的優(yōu)勢受體，Erβ基因的衰老性甲基化，對雌激素信號傳導通路中相關基因啟動子甲基化模式及正常的表達水平起著決定性作用：Erβ基因啟動子衰老性甲基化→ Erβ基因表達滅活→表遺傳學酶譜活性發(fā)生改變，下游的PR，c-fos等基因啟動子發(fā)生異常高甲基化→PR，c-fos等下游靶