子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞孕激素受體基因表現(xiàn)遺傳學(xué)調(diào)控的研究-DNA甲基化及表達(dá)沉默相關(guān)的染色質(zhì)成分變化.pdf

1、背景：子宮內(nèi)膜癌在我國是最常見的婦科腫瘤之一，威脅到很多女性的健康與生命。值得注意的是，一些研究表明雖然子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率基本穩(wěn)定，但死亡率似有上升趨勢。我們面臨的最大挑戰(zhàn)是如何提高病人的生存率。孕激素治療子宮內(nèi)膜癌的作用已經(jīng)得到公認(rèn)，但是晚期腫瘤中孕激素受體表達(dá)經(jīng)常缺失，導(dǎo)致其對孕激素的敏感性降低。因此孕激素受體陰性腫瘤對孕激素治療的低敏感性是目前臨床激素治療的重要課題。雖然已經(jīng)知道孕激素受體表達(dá)缺失可能與孕激素受體基因DNA的異常甲

2、基化有關(guān)，但其中具體的分子機(jī)制并不清楚。不知道異常甲基化是否起決定性的作用，也不清楚究竟在孕激素受體基因沉默的過程中其染色質(zhì)上發(fā)生了什么變化。搞清楚這些途徑不但有助于對于增進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的治療，而且可以幫助我們更好地理解表觀遺傳學(xué)調(diào)控的一般機(jī)制。
　　 目的：本課題將對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系中染色質(zhì)成分改變與孕激素受體基因轉(zhuǎn)錄沉默之間的關(guān)系進(jìn)行研究。具體來說進(jìn)行以下的四大部分實(shí)驗(yàn):1）確定PR-B在幾種細(xì)胞系中的表達(dá)與甲基化狀態(tài)；觀察D

3、NA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）及組蛋白乙?；福℉DAC）抑制劑對孕激素受體基因重新激活作用，找出最佳的時(shí)間與濃度。2）確定孕激素受體染色體成份的改變與孕激素受體表達(dá)的關(guān)系，逐個(gè)檢測MBD蛋白及組蛋白修飾在孕激素受體基因表達(dá)中的作用。3）觀察MBD及組蛋白表達(dá)水平與孕激素受體表達(dá)之間的關(guān)系。4）進(jìn)一步研究MeCP2在孕激素受體表達(dá)控制中的作用。
　　 方法：首先測定了十八種子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系中孕激素受體的表達(dá)水平，最終選定了孕激素受體

4、表達(dá)陽性和陰性的細(xì)胞系作進(jìn)一步的研究。采用甲基化特異性PCR的方法確定了孕激素受體的甲基化狀態(tài)，并使用染色體沉淀（ChromatinImmunoprecipitation，ChIP）的方法鑒定孕激素受體基因染色體上甲基化DNA結(jié)合蛋白和組蛋白翻譯后修飾在不同細(xì)胞、不同基因表達(dá)狀態(tài)下的狀況，以及在藥物處理前后的改變。
　　 結(jié)果：發(fā)現(xiàn)多種DNA結(jié)合蛋白，包括MeCP2，MBD1，MBD2，MBD3，MBD4在甲基化/表達(dá)沉默和非甲

5、基化/表達(dá)活躍的基因中呈現(xiàn)完全不同的結(jié)合狀態(tài)，用DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶和組蛋白乙酰化酶抑制劑處理后的細(xì)胞可引起MBD結(jié)合和組蛋白修飾的明顯改變。具體來說:1）在KLE和HEC1B細(xì)胞甲基化的PR-B啟動子區(qū)檢測到McCP2的結(jié)合。相反，在Ishikawa細(xì)胞非甲基化的啟動子區(qū)未發(fā)現(xiàn)MeCP2結(jié)合。2）MBD1和MBD2能結(jié)合甲基化和非甲基化的PR-B啟動子區(qū)。用ADC處理可以誘導(dǎo)MBD1與甲基化的（而非未甲基化）PR-B啟動子區(qū)的結(jié)合。同樣

6、的處理可以在KLE細(xì)胞中誘導(dǎo)MBD2的結(jié)合，而在HEC-1B或者Ishikawa細(xì)胞中沒有觀察到此作用。3）在任何細(xì)胞系都沒有發(fā)現(xiàn)有MBD3和MBD4的結(jié)合。4）TSA處理在任何一個(gè)細(xì)胞系都未能改變MBD的結(jié)合狀態(tài)。因此，不同的MBD家族成員表現(xiàn)出差異的和動態(tài)的與PR-B啟動子相互作用的狀態(tài)。
　　 接下來用ChIP方法檢測PR-B啟動子區(qū)H3 H4乙?；虷3賴氨酸9位甲基化和賴氨酸4位甲基化。我們觀察到:1）在三個(gè)細(xì)胞系中比

7、較總的H3 H4結(jié)合水平，甲基化的PR-B啟動子區(qū)比非甲基化的PR-B啟動子區(qū)H3和H4的乙酰化水平明顯低。2）使用ADC或者TSA處理會明顯的增加甲基化的PR-B啟動子區(qū)組蛋白乙?；健?）H3-K9甲基化水平在甲基化的PR-B啟動子區(qū)比非甲基化的PR-B啟動子區(qū)升高，而H3-K4甲基化顯示與其相反。4）用ADC和TSA處理KLE細(xì)胞，結(jié)果H3-K9明顯去甲基化，但卻能誘導(dǎo)H3-K4甲基化。5）與以上在甲基化的PR-B啟動子區(qū)的發(fā)現(xiàn)

8、相反，ADC和TSA處理沒有明顯的影響非甲基化的PR-B啟動子區(qū)組蛋白乙?；图谆?。
　　 結(jié)論：通過這一研究，認(rèn)識到H34位賴氨酸上的低甲基化和H39位賴氨酸上的高甲基化是表達(dá)沉默的孕激素受體基因啟動子的特點(diǎn)。經(jīng)DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶和組蛋白乙酰化酶抑制劑處理后MeCP2的結(jié)合及組蛋白修飾可以發(fā)生逆轉(zhuǎn)，導(dǎo)致孕激素受體基因的重新激活。免疫印跡檢測表明細(xì)胞內(nèi)整體水平上的蛋白濃度保持不變，說明這些改變特異性發(fā)生于孕激素受體基因的局

9、部，而與藥物在細(xì)胞整體的作用無關(guān)。為了進(jìn)一步證實(shí)MeCP2在孕激素受體基因表觀遺傳學(xué)中的重要作用，我們進(jìn)行了siRNA基因表達(dá)敲除實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明MeCP2對甲基化啟動子的結(jié)合對孕激素受體基因表達(dá)沉默至關(guān)重要。在MeCP2表達(dá)敲除的細(xì)胞中，MeCP2對孕激素受體基因的結(jié)合降低，于此相關(guān)聯(lián)，孕激素受體基因表達(dá)沉默發(fā)生部分逆轉(zhuǎn)，引起孕激素受體mRNA的上升。
　　 這些發(fā)現(xiàn)闡明了孕激素受體基因表達(dá)調(diào)控的一些重要特點(diǎn)與機(jī)制，為近年來這一

10、領(lǐng)域的首創(chuàng)，對于明確孕激素受體基因的表觀遺傳學(xué)提供了重要的信息。這些發(fā)現(xiàn)將有助于設(shè)計(jì)新的表觀遺傳干預(yù)方法以重新激活孕激素受體的表達(dá)，從而增進(jìn)孕激素受體陰性的子宮內(nèi)膜癌對激素治療的敏感性。比如說，可以使用甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑（如ADC）和組蛋白去乙?；敢种苿ㄈ鏣SA）對孕激素受體腫瘤陰性病人進(jìn)行預(yù)處理，等孕激素受體表達(dá)后再給予大劑量孕激素殺死腫瘤細(xì)胞。因?yàn)槎鄶?shù)死于晚期或手術(shù)后復(fù)發(fā)的子宮內(nèi)膜癌病例的孕激素受體為陰性，所以這種治療方法有巨大